Флюоресцентная гибридизация in situ. Гибридизация нуклеиновых кислот in situ Метод основан на Применение флюоресцентной гибридизации in situ - технологии FISH

Лекция 4.

Гибридизация хромосом

Введение

Для выяснения локализации отдельных генов на хромосомах (то есть картирования генов) используют целый арсенал специальных методов. Один из основных – молекулярная гибридизация (образование гибрида) гена или его фрагмента с фиксированными на твердой подложке препаратами хромосом, выделенными из клеток в чистом виде (это называют гибридизацией in situ). Суть метода гибридизации in situ заключается во взаимодействии (гибридизации) между денатурированными (расплетенными) нитями ДНК в хромосомах и комплементарными нуклеотидными последовательностями, добавленных к препарату хромосом однонитевых ДНК или РНК (их называют зондами).

Гибридизация in situ с флуоресцентной меткой (FISH)

Данный метод позволил перейти от изучения морфологии хромосом к анализу последовательностей ДНК, входящих в их состав.В методе FISH используются флуоресцирующие молекулы для прижизненной окраски генов или хромосом. Метод используется для картирования генов и идентификации хромосомных аберраций.

Методика начинается с приготовления коротких последовательностей ДНК, называемых зондами, которые являются комплементарными по отношению к последовательностям ДНК, представляющим объект изучения. Зонды гибридизуются (связываются) с комплементарными участками ДНК и благодаря тому, что они помечены флуоресцентной меткой, позволяют видеть локализацию интересующих генов в составе ДНК или хромосом. В отличие от других методов изучения хромосом, требующих активного деления клетки, FISH можно выполнять на неделящихся клетках, благодаря чему достигается гибкость метода.

FISH может применяться для различных целей с использованием зондов трех различных типов:

• локус-специфичные зонды , связывающиеся с определенными участками хромосом. Данные зонды используются для идентификации имеющейся короткой последовательности выделенной ДНК, которая используется для приготовления меченого зонда и его последующей гибридизации с набором хромосом;
• альфоидные или центромерные зонды-повторы представляют собой повторяющиеся последовательности центромерных областей хромосом. С их помощью каждая хромосома может быть окрашена в различный цвет, что позволяет быстро определить число хромосом и отклонения от нормального их числа;
• зонды на всю хромосому являются набором небольших зондов, комплементарных к отдельным участкам хромосомы, но в целом покрывающими всю ее длину. Используя библиотеку таких зондов можно "раскрасить" всю хромосому и получить дифференциальный спектральный кариотип индивида. Данный тип анализа применяется для анализа хромосомных аберраций, например транслокаций, когда кусочек одной хромосомы переносится на плечо другой.

Материалом для исследования является кровь, костный мозг, биопсия опухоли, плацента, эмбриональные ткани или амниотическая жидкость. Могут использоваться как метафазные, так и интерфазные препараты клеток. Меченные флуоресцентными метками специфические ДНК-зонды гибридизуюся с хромосомной ДНК, причем можно одновременно использовать множественные зонды к разным локусам.

FISH является полезным и чувствительным методом цитогенетического анализа при выявлении количественных и качественных хромосомных аберраций, таких как делеции (в том числе и микроделеции), транслокации, удвоение и анэуплоидия. FISH на интерфазных хромосомах служит быстрым методом пренатальной диагностики трисомий по 21, 18 или 13 хромосомам или аберраций половых хромосом. В онкологии с помощью FISH можно выявлять рад транслокаций, связанных с гематологическими злокачественными новообразованиями. Метод также может использоваться для мониторинга остаточных явлений онкозаболевания после химиотерапии и пересадки костного мозга и выявления усиленных онкогенов, связанных с неблагоприятным прогнозом в отношении некоторых опухолей. FISH также используется для контроля приживаемости аллотрансплантата костного мозга, полученного от индивида противоположного пола. FISH также применяют для детекции и определения расположения специфических мРНК в образце ткани. В последнем случае метод FISH позволяет установить пространственно-временные особенности экспрессии генов в клетках и тканях.

FISH является чувствительным методом для идентификации хромосомных аберраций и одномоментного быстрого анализа большого (>500) числа клеток. Метод обладает высокой точностью при идентификации природы хромосом и неизвестных фрагментов хромосомной ДНК.

Таким образом, общий вид протокола для постановки FISH можно представить в следующем виде:

1) Подготовка гистологического или цитологического препарата

Подготовка гистологического препарата осуществляется по стандартной схеме: вырезка, маркировка, проводка, заливка, микротомия, помещение среза на предметное стекло и депарафинизация. При подготовке цитологического препарата используются специальные осаждающие растворы и центрифугирование, что позволяет получить концентрированную суспензию клеток.

2) Предварительная обработка (если необходимо)

Препарат обрабатывается протеазами, чтобы исключить присутствие белков, которые затрудняют гибридизацию.

3) Нанесение ДНК-зонда на препарат и последующая денатурация

Для того чтобы денатурировать зонд и ДНК образца, их обрабатывают формамидом и нагревают до температуры около 85–90ºС.

4) Гибридизация

После денатурации препарат охлаждают до определенной температуры (37ºС в случае клинических исследований) и инкубируют во влажной камере в течение нескольких часов (продолжительность инкубации указана в каждом конкретном протоколе). В настоящее время для денатурации и гибридизации используют автоматические гибридайзеры.

5) Промывка.

После того, как гибридизация завершена, необходимо отмыть несвязавшиеся зонды, которые, в противном случае, создадут фон, затрудняющий оценку результатов FISH-анализа. Для промывки обычно используют раствор, содержащий цитрат и хлорид натрия (SSC).

6) Контрокрашивание

При помощи флуоресцентных красителей (DAPI - 4,6-диамидин-2-фенилиндол; йодид пропидия) проводится окраска всей ядерной ДНК.

7) Анализ результатов при помощи флуоресцентного микроскопа

Особенно важным для изучения генома человека на первых этапах его исследования стал метод, называемый гибридизацией соматических клеток. При смешивании соматических (неполовых) клеток человека с клетками других видов животных (чаще всего для этой цели использовали клетки мышей или китайских хомячков) в присутствии определенных агентов может происходить слияние их ядер (гибридизация). При размножении таких гибридных клеток происходят потери некоторых хромосом. По счастливой для экспериментаторов случайности в гибридных клетках человек–мышь происходит потеря большей части хромосом человека. Далее отбираются гибриды, в которых остается только какая–нибудь одна человеческая хромосома. Исследования таких гибридов позволили связать некоторые биохимические признаки, свойственные клеткам человека, с определенными хромосомами человека. Постепенно благодаря использованию селективных сред научились добиваться сохранения или потери отдельных хромосом человека, несущих определенные гены.

Для того чтобы облегчить слияние клеток разных видов, в культуральную среду добавляют вирус Сендай, инактивированный ультрафиолетовым облучением, или полиэтиленгликоль. Для отбора слившихся клеток от исходных клеток человека и мыши клетки выращивают на специальной селективной среде, которая позволяет размножаться только гибридным клеткам.

На сегодняшний день хромогенная гибридизация in situ является более доступным методом, чем флуоресцентная. Если речь идет о флуоресцентной гибридизации in situ, то ДНК-зонд коньюгирован с флуоресцентной меткой. Результаты такого исследования оценивают во флуоресцентном микроскопе. В случае хромогенной гибридизации in situ, ДНК-зонд коньюгируют с пероксидазой или чем-либо другим и проводят окрашивание хромогеном. В этом случае результаты оценивают под обычным световым микроскопом.

ü Преимущества FISH-метода

В качестве основных преимуществ FISH можно выделить следующие:

1) возможность исследования генетического материала в интерфазных ядрах;

2) получение объективных результатов по принципу «да/нет» - это количественный метод;

3) относительно простая интерпретация результатов;

4) высокая разрешающая способность.

ü Недостатки FISH-метода

1) флуоресцентные красители быстро «выцветают»;

2) для анализа результатов необходим высококачественный флуоресцентный микроскоп.

FISH (флуоресцентная гибридизация in situ) является незаменимым методом в диагностике онкологических заболеваний. С помощью специфических флуоресцентных зондов этот метод позволяет идентифицировать наличие геномных перестроек, то есть уточнить диагноз, уточнить прогноз и подобрать адекватную терапию - в зависимости от конкретного случая. Прежде всего, этот подход используется при онкогематологических заболеваниях. Ранее для этих целей использовали обычное кариотипирование, но, если клетки больного не дают выраженного роста в культуре, это серьёзно осложняет диагностику данным методом. В этих случаях применение FISH существенно расширяет возможности лабораторной диагностики. Кроме того, сложные хромосомные перестройки проще интерпретировать при использовании FISH.

В лаборатории используются зонды к центромерам, специфическим участкам хромосом, генов. Двухцветные зонды подбираются для поиска транслокаций таким образом, что если фрагменты двух генов, которые в норме находятся в разных участках генома, оказываются рядом, два сигнала различного цвета - по одному от каждого зонда, сливаются в один, отличающийся по свету от исходных. Так, например, выявляют распространённые среди лейкозов различных типов транслокации BCR-ABL. Такие гены, как MLL, TEL и RARα могут перестраиваться, образуя химерные гены с различными последовательностями. В этом случае два зонда подбираются к разным краям гена. Если ген цел, на препарате в каждом ядре будет одна точка, при разрыве - две точки разного цвета. За счёт этого FISH является более гибкой методикой для выявления хромосомных транслокаций, чем ПЦР. Зонд сядет на хромосому вне зависимости от того, как именно произошёл разрыв и присоединение фрагмента другой хромосомы в рамках какого-либо специфического участка, в отличие от олигонуклеотидов, применяемых в ПЦР, распознающих конкретные, хотя и распространённые перестройки.

Панель маркеров, выявляемых FISH позволяет оценить прогноз при хроническом лимфоидном лейкозе. Делеции 11q и 17p ассоциированы с неблагоприятным прогнозом, в делеция 13q, как и нормальный кариотип - с благоприятным. При трисомии по хромосоме 12 случай можно отнести к промежуточной группе риска.

Категория риска при миеломе связана также с сочетанием делеций и транслокаций, транслокации t(4;14), t(14;16) и делеция 17p связаны с неблагоприятным прогнозом. Такие диагностические исследования проводятся на биоптатах красного костного мозга после обогащения. Небольшая инверсия, сопровождающаяся формированием химерного гена EML4-ALK, характерна для немелкоклеточного рака лёгкого. Продукт химерного гена - мишень таргетной терапии. Такую перестройку тоже можно выявлять методом FISH. Амплификацию HER2 зачастую оценивают по косвенному признаку - возрастанию уровня экспрессии, используя для этого метод иммуногистохимии, однако в ряде стран рекомендуется использовать для этих целей FISH, или, по крайней мере, использовать этот метод для подтверждения.

Флюоресцентная гибридизация in situ

Флюоресце́нтная гибридиза́ция in situ , или метод FISH (англ. Fluorescence in situ hybridization - FISH ) - цитогенетический метод, который применяют для детекции и определения положения специфической последовательности ДНК на метафазных хромосомах или в интерфазных ядрах in situ . Кроме того, FISH используют для выявления специфических мРНК в образце ткани . В последнем случае метод FISH позволяет установить пространственно-временные особенности экспрессии генов в клетках и тканях.

Зонды

При флюоресцентной гибридизации in situ используют ДНК-зонды (ДНК-пробы), которые связываются с комплементарными мишенями в образце. В состав ДНК-зондов входят нуклеозиды , меченные флюорофорами (прямое мечение) или такими конъюгатами, как биотин или дигоксигенин (непрямое мечение). При прямом мечении связавшийся с мишенью ДНК-зонд можно наблюдать при помощи флюоресцентного микроскопа сразу по завершении гибридизации. В случае непрямого мечения необходима дополнительная процедура окрашивания, в ходе которой биотин выявляют при помощи флуоресцентно-меченного авидина или стептавидина, а дигоксигенин - при помощи флюоресцентно-меченых антител. Хотя непрямой вариант мечения ДНК-проб требует дополнительных реактивов и временных затрат, этот способ позволяет добиться обычно более высокого уровня сигнала за счёт присутствия на молекуле антитела или авидина 3-4 молекул флюорохрома. Кроме того, в случае непрямого мечения возможно каскадное усиление сигнала.

Для создания ДНК проб используют клонированные последовательности ДНК, геномную ДНК, продукты ПЦР -реакции, меченые олигонуклеотиды , а также ДНК, полученную при помощи микродиссекции .

Мечение зонда может осуществляться разными способами, например, путем ник-трансляции или при помощи ПЦР с мечеными нуклеотидами.

Процедура гибридизации

Схема эксперимента по флюоресцентной гибридизации in situ для локализации положения гена в ядре

На первом этапе происходит конструирование зондов. Размер зонда должен быть достаточно большим для того, чтобы гибридизация происходила по специфическому сайту, но и не слишком большой (не более 1 тыс п.о), чтобы не препятствовать процессу гибридизации. При выявлении специфических локусов или при окраске целых хромосом надо заблокировать гибридизацию ДНК-проб с неуникальными повторяющимися ДНК-последовательностями путём добавления в гибридизационную смесь немеченой ДНК повторов (например, Cot-1 DNA). Если ДНК-зонд представляет собой двуцепочечную ДНК, то перед гибридизацией её необходимо денатурировать.

На следующем этапе приготавливают препараты интерфазных ядер или метафазных хромосом. Клетки фиксируют на субстрате, как правило, на предметном стекле, затем проводят денатурацию ДНК. Для сохранения морфологии хромосом или ядер денатурацию проводят в присутствии формамида , что позволяет снизить температуру денатурации до 70°.

Визуализацию связавшихся ДНК-зондов проводят при помощи флуоресцентного микроскопа. Интенсивность флюоресцентного сигнала зависит от многих факторов - эффективности мечения зондом, типа зонда и типа флюоресцентного красителя.

Литература

• Рубцов Н.Б. Методы работы с хромосомами млекопитающих: Учеб. пособие / Новосиб. гос. ун-т. Новосибирск, 2006. 152 с.

• Рубцов Н.Б. Гибридизация нуклеиновых кислот in situ в анализе хромосомных аномалий. Глава в книге «Введение в молекулярную диагностику» Т. 2. «Молекулярно-генетические методы в диагностике наследственных и онкологических заболеваний» / Под ред. М.А. Пальцева, Д.В. Залетаева. Учебная литература для студентов медицинских вузов. М.: Медицина, 2011. Т. 2. С. 100–136.

Примечания

Wikimedia Foundation . 2010 .

Смотреть что такое "Флюоресцентная гибридизация in situ" в других словарях:

У этого термина существуют и другие значения, см. гибридизация. Гибридизация ДНК, гибридизация нуклеиновых кислот соединение in vitro комплементарных одноцепочечных нуклеиновых кислот в одну молекулу. При полной комплементарности… … Википедия

Возможности гибридизации in situ могут быть значительно повышены за счет одновременного использования нескольких флуоресцентных цветов. Многоцветная флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) в своем простейшем варианте может быть использована для маркировки (окрашивания) многих характеристик, поскольку в гибридизации применяются различные флуорофоры. При использовании не одних цветов, а их комбинаций, с помощью микроскопов с цифровой обработкой изображений в отдельных клетках можно одновременно обнаруживать гораздо больше выделенных красителями характеристик.

Рис. 1. Многоцветная FISH

Для подробного ознакомления с флуоресцентными микроскопами основных мировых производителей оптических систем и сопутствующего оборудования посетите наш каталог или свяжитесь с нашими специалистами и получите полную профессиональную консультацию по любым, имеющимся у Вас, вопросам.

На рисунке 1 представлен типичный образец многоцветной флуоресцентной гибридизации - FISH. Нормальные мужские лимфоциты были гибридизированы с FITC-биотином, окрашенным Chr2l и ChrY зондами, и CY3-дигоксигенином, окрашенным Chrl3 и ChrY зондами. Вверху слева - снимок ядер ДНК, окрашенных ДАПИ, полученный с помощью ДАПИ фильтра. Вверху справа - снимок Chr2l и ChrY, окрашенных FITC, полученный с помощью FITC-фильтра. Внизу слева - снимок Chrl3 и ChrY, окрашенныхCY3, полученный с помощью CY3 фильтра. Нижний правый снимок является комбинированным изображением, на котором в цвете представлены все хромосомы-мишени. Этот образец был предоставлен доктором Тимом Хоузилом, Интегрейтид генетикс, Фраминхэм, Массачусетс.

Техника многоцветной FISH, объединенная с методами цифровой обработки изображений, на сегодня предлагает не имеющие себе равных возможности неизотопного обнаружения множественных последовательностей нуклеиновых кислот для анализа компонентов клеток, хромосом и генов.

Флуоресценция - явление, при котором химическое соединение возбуждается на одной длине световой волны, а излучает на другой, обычно большей - применяется во всех биологических науках для изучения разнообразных структур и внутриклеточных процессов. Технологические успехи в разработке красителей и микроскопов привели за последнее десятилетие к быстрому развитию флуоресцентных методов.

В этой обзорной статье будут изложены основы FISH-метода, ограничения, с которыми столкнулись исследователи за годы применения FISH, последние разработки аппаратного и программного обеспечения, красителей и реагентов, повлиявшие на развитие этого метода, и текущие направления в этой области. Новейшие достижения этого метода, приведшие к его применению не только в исследовательских лабораториях, но в клинической диагностике, будут также рассмотрены в этой статье.

Обзор метода FISH

Применение FISH стремительно растет в геномике, цитогенетике, пренатальных исследованиях, биологии новообразований, радиоактивном маркировании, генном картировании, амплификации генов и основных биомедицинских исследованиях. В принципе, этот метод достаточно прост.

Гибридизацией идентифицируются, или помечаются, геномные последовательности-мишени, таким образом, что можно наблюдать их местоположение и размер. Последовательности ДНК или РНК из подходящих, в зависимости от хромосомы, зондов сначала помечаются репортерными группами, которые позже идентифицируются с помощью флуоресцентной микроскопии. Помеченный ДНК или РНК зонд потом гибридизируется с метафазными хромосомами или покоящимися ядрами на предметном стекле. После промывания и усиления сигнала образец исследуется по репортерным группам с помощью флуоресцентной микроскопии.

FISH позволяет достигать очень высокого пространственного разрешения морфологических и геномных структур. Этот метод довольно быстрый, простой в осуществлении и характеризуется высокой стабильностью красителей. В зависимости от используемого зонда можно определить геном отдельной особи, целые хромосомы, участки хромосом и последовательности уникальных копий.

Прежние ограничения

До недавнего времени FISH была ограничена аппаратным и программным обеспечением, реагентами, технологией получения красителей и высокой стоимостью исполнения. Серийно выпускаемые аппаратные средства для микроскопов, оптимизированные для многоцветной FISH, были недоступны до середины 1990-х годов. До этого микроскопы приходилось специально настраивать для приложений FISH. Большинство микроскопической оптики не было предназначено для обнаружения световых сигналов низкого уровня, характерных для FISH. Поскольку при использовании этого метода существенно улучшилось разрешение геномов, возросли и требования к микроскопической оптике. Представляли проблему и хроматические аберрации на многих длинах волн. Для многоцветного анализа в особенности, все линзы, включая собирающую линзу, должны были иметь коррекцию хроматических аберраций. К тому же, очень трудно было настраивать эпифлуоресцентные источники света для получения равномерного освещения.

Анализ снимков многоцветной FISH требует разделения различных сигналов либо (а) отдельными фильтр-кубами, либо (b) использованием насадки светофильтров возбуждения с широкополосными дихроичными и пороговыми фильтрами. Развитие технологии фильтров исправило некоторые прежние проблемы, вызванные оптической несоосностью и разъюстировкой, вызываемых механическим переключением между отдельными фильтр-кубами. Сменные фильтры света возбуждения, применяемые с многополосными дихроичными и пороговыми фильтрами, могут эффективно работать с тремя цветами при использовании отдельных фильтров возбуждения для каждого цвета без регистрации сдвига. Но при работе более чем с тремя цветами все же надо использовать однополосные фильтры.

Для сбора данных использовались высокочувствительная цветная пленка или ПЗС (прибор с зарядовой связью), и в обоих случаях были проблемы с точностью цветопередачи. В дополнение, были проблемы с наложением изображений разных цветов, снятых с одного образца с применением различных красителей-зондов.

Программное обеспечение для количественного анализа образцов, приготовленных с помощью флуоресцентных реагентов, также оставляло желать лучшего, поскольку существующие системы анализа изображений не были оптимизированы для работы с флуоресцентными образцами выборки. Визуальный анализ является трудоемкой и часто субъективной процедурой, поэтому без использования передовых достижений флуоресцентной визуализации анализ флуоресцентных выборок был труден и допускал двоякое толкование. Исследователям обычно приходилось иметь в штате собственных программистов для разработки собственных программ для анализа изображений.

Самих реагентов и красителей было недостаточно для всех приложений. Например, эффективность определения места гибридизации падала с уменьшением размера зонда, что накладывало серьезные ограничения на те образцы, которые, можно наблюдать флуоресцентной микроскопией. Число различных флуоресцентных красителей было ограничено; к тому же они обладали невысокой фотостабильностью. Но развитие технологии флуоресцентных красителей и сопутствующих технологий в рамках федерально финансируемого Проекта «Геном человека» сейчас приносят свои плоды. Уже существуют зонды для всех хромосом человека, а также растет число доступных зондов генов. Наборы для гибридизации in situ и флуоресцентно-отмеченные зонды сегодня серийно выпускаются несколькими компаниями.

Цена была еще одним серьезным препятствием. Поскольку на рынке не было серийно выпускаемых FISH систем, исследователям приходилось собирать системы, получаемые под заказ, включая реагенты, зонды, микроскоп, аппаратное и программное обеспечение по обработке изображений, анализу данных и разработке отчетов. Проведение многоцветной FISH с комплексным анализом изображения могло стоить исследователю более $200 000 - сумма труднодоступная для большинства клинических исследователей. В результате, многие исследователи, желающие использовать FISH в своих лабораториях, не имели такой возможности.

FISH стала широко доступной

Многие производители аппаратного и программного обеспечения разработали доступные серийно выпускаемые системы, как альтернативу системам под заказ. Атмосфера сотрудничества, возникшая среди многих фирм и лабораторий, занимающихся FISH, привела к новым прорывам в этой области. И свои достижения авторы публикуемых работ рассматривают именно в рамках такого сотрудничества.

Рис. 2. Рабочий экран программы MultiFluor

Система, работающая в Соединенных Штатах и обеспечивающая средние цены для серийно выпускаемых для исследований FISH систем, объединяет компоненты многих производителей и полагается на последние достижения в программной обработке изображений, аппаратном обеспечении микроскопов и других аксессуаров. Для клинических исследовательских лабораторий эта система оказывается полезной во многих приложениях. Будучи интегрированной и автоматизированной, она позволяет проводить клинические испытания в полном объеме.

Система программного обеспечения, представленная здесь - MultiFluor ™ -многопараметрическая система визуализации (Системы исследования биологических структур), разработанная на базе Microsoft® Windows (корпорация Майкрософт, Беллевуе, Вашингтон) и предназначенная для обнаружения, анализа и представления структурных и молекулярных характеристик, полученных по выборкам многоцветной FISH. Время анализа и точность результатов улучшены благодаря соотнесению многих характеристик на различных длинах волн в каждой выборке. Эта система облегчает получение изображения, его хранение, управление базой данных, автоматическое управление микроскопом и полнофункциональный графический анализ данных.

На рисунке 2 изображен экран с обзорным представлением данных программы MultiFluor. Пользователи могут просмотреть снимки и соответствующие им данные, сопоставить многопараметрические данные, полученные в разных цветах (на разных длинах волн) с помощью различных инструментов графического построения, включая гистограммы, диаграммы рассеяния и т. д. Здесь различные графики показаны вместе с набором многоцветных снимков клетки (изображающих ДАПИ-ядра, FITC-ChrX, CY3-ChrY и CY5-Chr2l), наряду с исходными данными, представленными в таблице.

Исследователи FISH имеют возможность автоматически получать снимки на разных длинах волн в разных фокальных плоскостях, визуализировать зонды многоцветной FISH, снабжать снимки примечаниями и распечатывать их, хранить и извлекать большие объемы данных наборов многоцветных изображений. Метафазные хромосомы многоцветной FISH могут быть проанализированы генным картированием, с помощью сравнительной геномной гибридизации (СГГ), а также генерацией кариотипов. Выбранные пользователем области образца могут быть просканированы и проанализированы. Программа автоматически фокусирует систему, получает снимки на многих длинах волн, запоминает положение клеток на предметном стекле, измеряет различные характеристики, включая подсчет зонда, интенсивность флуоресценции и морфометрию клетки. Различные характеристики на различных длинах волн могут быть соотнесены друг с другом.

Дополнительной характеристикой системы является возможность ее работы с персональными компьютерами (ПК), объединенными в сеть. В типичной конфигурации один компьютер является онлайновой станцией, соединенной с аппаратным обеспечением камеры и микроскопа. Этот компьютер управляет получением снимков и производит мгновенный анализ. Другие ПК являются вторичными станциями анализа информации, где обрабатываются данные, поступившие с первого ПК, или где автономно выполняется какой-либо специальный анализ.

Программа позволяет представить все компоненты в ярких псевдоцветах для одновременной многоцветной визуализации. Например, одновременные снимки четырехцветного эксперимента (с использованием ДАПИ (синий), FITC (зеленый), CY3 (красный), и комбинации FITC- CY3 (желтый)) могут быть представлены отдельно или быть объединены в одно изображение (как показано на рисунке 1). Каждый снимок может быть интерактивно усилен для выделения интересующих характеристик. С помощью программы легко создавать гистограммы, диаграммы рассеяния, таблицы, линейные графики и другие формы представления и оценки данных (рисунок 2). К тому же данные хранятся в легко доступных и популярных форматах, таких как TIFF, JPEG, GIF и других.

Онкологические, пренатальные и биологические исследования

Описываемые FISH системы разработаны для обеспечения большей доступности исследователям, чем прежние, изготавливаемые под заказ. Они все больше применяются в онкологии, изучении патологий, цитогенетике и биологии развития. Среди их приложений такие, как анализ интерфазных клеток по количеству пятен при наблюдении с многоцветными красителями, иммунофенотипирование, морфометрия клетки и состав ДНК.

С помощью этих систем проводится анализ отклонений в числе копий хромосом, соотнесенных с общим составом ДНК, которые связаны с образованием опухолей мочевого пузыря. В пренатальных исследованиях эти системы могут использоваться для обнаружения анеуплоидий в покоящихся ядрах, связанных с пренатальными дефектами, включая синдром Дауна, синдром Тернера, синдром Клайнфельтера и другими. В клеточной биологии и биологии развития эта система может использоваться для картирования маркеров поверхности клетки и их относительного распределения, таких как рецепторы, маркеров цитоплазмы, включая белки цитоскелета, информационные РНК и специфические гены.

Диагностический потенциал

За последние полтора десятилетия стало понятно, что FISH метод имеет чрезвычайно большой потенциал не только как инструмент в исследовательской работе, но и в клинической диагностике в таких областях, как пренатальная диагностика, цитогенетика и развитие опухолей. Отсутствие высококачественных, доступных по цене систем, не только тормозило распространение FISH среди исследователей, но делало этот метод недостижимым для диагностических центров многих медицинских учреждений

Результаты, которые раньше могли быть получены лишь с помощью дорогостоящего, изготовленного под заказ оборудования, сейчас могут быть получены с помощью этой системы - и это является одним из наиболее важных ее достоинств. Мечта применить FISH не только для более широкого круга биомедицинских исследований, но и прямо поставить ее на службу пациентам, возможно, станет реальностью в не столь отдаленном будущем.

Флуоресцентная стереомикроскопия

Эпифлуоресцентное освещение

До недавнего времени, флуоресцентное освещение было доступно лишь на исследовательских микроскопах, оборудованных специальными светосильными объективами. Необходимость стереомикроскопии в этой методике усилилась с появлением генетически кодированных и биологически специфичных флуоресцентных белков, таких как GFP (зеленый флуоресцентный белок).

Рис. 1. Стереомикроскоп с эпифлуоресцентным осветителем

Применение стереомикроскопов для наблюдения GFP настолько распространено, что стерео флуоресцентные осветители чаще называются GFP-осветителями, несмотря на то, что они могут использоваться во многих других приложениях, как в биологических науках, так и в электронной промышленности. Большие образцы, такие как личинки, нематоды, полосатый данио, ооциты и зрелые насекомые легко наблюдать (и ими легко манипулировать), если они окрашены GFP и освещаются светом флуоресценции. Флуоресцентное освещение выявляет, какие организмы производят флуоресцентный белок, а стереоскопический способ наблюдения, в сочетании с большим полем зрения и большим рабочим расстоянием, позволяет наблюдателю пользоваться во время эксперимента пинцетом, пипетками или микроманипуляторами. Другие, более типичные образцы, также легко исследовать с помощью стереомикроскопов с флуоресцентным освещением.

Осветитель для эпифлуоресценции на стереомикроскопе функционирует подобно тем, которые установлены на более сложных микроскопах. Обычно, флуоресцентный осветитель представляет собой ксеноновую или ртутную дуговую лампу, помещенную во внешний блок осветителя, который соединяется микроскопом через промежуточный тубус (или вертикальный осветитель, см. рисунок 1 и 2), расположенный между трансфокатором микроскопа и окулярными тубусами. На сегодняшний день этот тип освещения ограничен приложениями, в которых применяются стереомикроскопы с общим главным объективом (CMO), поскольку для настройки стереомикроскопа Грену или другого стереомикроскопа, основанного на схеме сведения лучей, под свет флуоресценции невозможно использование серийно выпускаемых деталей.

Свет, излучаемый дуговой лампой, направляется через настраиваемую собирающую линзу-коллектор на возбуждающий фильтр, находящийся в комбинированном блоке светофильтров (как показано на рисунках 2 и 3). Этот фильтр пропускает свет лишь в определенном волновом диапазоне (полосе пропускания). Свет, прошедший через фильтр, отклоняется затем по оптическому пути микроскопа в его нижнюю часть (модуль трансфокатора и объектив в стереомикроскопе) и направляется на образец дихроичным зеркалом, которое, в зависимости от настройки, отражает, селективно-фильтрует и/или пропускает свет определенных длин волн/областей спектра. Термин дихроичное (или дихроматическое) отображает свойство фильтра или зеркала «различать» цвета падающего света, отражая свет того цвета, который оказывается ниже заданного предела длин волн, и, пропуская цвета выше этого предела.

Рис. 2. Ход лучей во флуоресцентном стереомикроскопе

Сфокусированный пучок света возбуждения проходит через трансфокатор и объектив, где образует перевернутый световой конус, облучающий образец, вызывающий возбуждение всех флуорофоров в образце, полоса поглощения которых соответствует полосе пропускания облучающего света. Вторичное флуоресцентное свечение (с длиной волны обычно большей возбуждающего света), испускаемое из образца, захватывается общим главным объективом стереомикроскопа и направляется обратно через трансфокатор к пороговому фильтру, который блокирует свет на длине волны возбуждения и пропускает лишь свет с длиной волны испускания. Тубус микроскопа на рисунках 1 и 2 сконструирован таким образом, что более длинные волны флуоресцентного испускания, проходя обратно, через левый и правый оптические каналы трансфокатора, фокусируются независимо перед тем, как они достигнут эпифлуоресцентного осветителя. Свет из левого канала проходит прямо к пороговому фильтру, после которого направляется в окулярные тубусы или в фотопорт. Напротив, свет в правом канале сначала направляется обратно через дихроичное зеркало, а потом к пороговому фильтру и окулярам. Этот свет не имеет выхода в порт камеры и может быть использован только для наблюдения образца.

Детали конструкции флуоресцентного комбинированного блока фильтров представлены на рисунках 2 и 3. Каждый блок содержит однополосный фильтр света возбуждения, два пороговых фильтра и дихроичное зеркало. Свет ртутной дуговой лампы попадает в блок светофильтров через возбуждающий фильтр, и отражается от поверхности дихроичного зеркала, как говорилось выше, и как показано на рисунке 3. Вторичное флуоресцентное излучение проходит через пороговые фильтры. Возбуждающий фильтр, дихроичное зеркало и пороговый фильтр левого канала вклеены в систему, а пороговый фильтр правого канала закреплен в небольшой рамке, которая может быть удалена из блока, если ослабить ее крепежные винты. Сняв пороговый фильтр, можно получить доступ к дихроичному зеркалу, расположенному внутри блока фильтров. При установке сменных фильтров, следите за тем, чтобы клей не попал на поверхность фильтров, и перед тем, как брать фильтры и дихроичное зеркало, обязательно надевайте перчатки, чтобы не испачкать поверхность отпечатками пальцев.

Флуоресцентный вертикальный осветитель может вместить три блока светофильтров и пустой блок диа-фильтров (без фильтров) для обычного наблюдения по методу светлого поля. Блоки фильтров крепятся на направляющих и устанавливаются в оптический путь с помощью рукоятки, используемой для контроля положения направляющих. К каждому блоку прилагается соответствующая идентификационная табличка-пластина. Таблички вставляются в щелевое отверстие в корпусе осветителя в последовательном порядке, чтобы оператор мог легко выбрать нужный блок фильтров для флуоресцентного наблюдения.

Рис. 3. Комбинации фильтров флуоресценции в стереомикроскопе

Набор комбинаций фильтров, представленный в таблице 1. Эти фильтры охватывают широкий диапазон флуоресцентного возбуждения и испускания и должны быть полезны во многих биологических исследованиях, где применяются обычные флуоресцентные красители. Эти комбинации фильтров также подходят для промышленного использования, как например, для анализа полупроводниковых пластин с ИС на загрязнение флуоресцентными полимерами фоторезистов. С помощью подбора соответствующей комбинации фильтров возбуждения/испускания, могут использоваться флуоресцентные зонды с длинами волн возбуждения в диапазоне от 380 до 510 нанометров (см. таблицу 1). Эти комбинации фильтров также весьма полезны в исследованиях с различными мутантами зеленых флуоресцентных белков, включая их голубую и синюю разновидность.

В культурах живых клеток с флуоресцентными метками белков, интенсивность сигнала может быть значительно повышена, если комбинации фильтров точно соответствуют профилю возбуждения и испускания флуорофоров. Например, в случае DS-красных сигналов, визуальное наблюдение и регистрация изображения красной флуоресценции фотоприемниками могут быть значительно улучшены за счет смещения красного сигнала в сторону эмиссии более оранжевого света. В дополнение, комбинации фильтров, подобранные для исследований образцов растений, с интенсивной фоновой автофлуоресценцией хлорофилла, часто бывают более эффективны при точном подборе соответствующих спецификаций фильтра и эмиссионного сигнала. Многие из этих критериев учитываются инженерами-разработчиками микроскопов для оптимизации полосы пропускания различных комбинаций фильтров стереомикроскопов.

Табл. 1. Комбинации флуоресцентных фильтров стереомикроскопов

Комплект фильтров	Диапазон длин волн возбуждения	Дихроичное зеркало	Диапазон длин волн испускания
Синий GFP/DAPI
Голубой (EGFP) GFP
Полоса пропускания GFP
Расширенная полоса пропускания GFP
TRITC (Ds-красный)
Полоса пропускания желтого GFP

Как и все чувствительные интерференционные фильтры, фильтры комбинированного блока со временем выходят из строя из-за интенсивного светового и ультрафиолетового облучения. Такие характеристики, как полоса пропускания и коэффициент пропускания, также меняются при использовании и хранении фильтров в среде с повышенной влажностью. Для увеличения срока службы такие фильтры следует хранить в сушильном шкафу или герметично закрытом контейнере с влагопоглотителем. Если наблюдения не проводятся, затвор осветителя следует держать закрытым, чтобы уменьшить количество света, проходящее через фильтры. Чистку фильтра можно производить только сухим воздухом из баллончика, мягкой щеткой из верблюжьей шерсти или безмасляным газом из газового баллона. Во избежание царапин и потертостей, никогда не протирайте фильтры с мягким интерференционным покрытием фильтров, тканью для протирки линз.

Фокусировка и юстировка дуговых ламп

Приобретите практический опыт юстировки и фокусировки дуговых ламп с помощью данного обучающего интерактивного приложения Mercury or Xenon Burner, в котором смоделированы все процессы юстировки лампы во флуоресцентном микроскопе.

С помощью стереомикроскопов можно наблюдать различные образцы в свете флуоресценции. Благодаря увеличению объектива от 0,5х до 1,6х и диапазону трансфокации до 15х, эти стереомикроскопы могут обеспечить общее увеличение системы от 4х до 540х, что сравнимо с диапазоном наблюдения классических сложных микроскопов. Широкий диапазон увеличения позволяет микроскопистам наблюдать как большие живые образцы, так и мелкие детали в тонких срезах, окрашенных флуорохромами, помещенных на предметном стекле. Пример наблюдения в свете флуоресценции с высоким коэффициентом увеличения приведен на рисунке 4. На нем представлен окрашенный тремя метками толстый образец почки мыши. Образец был окрашен ДАПИ, Alexa Fluor 488 WGA и Alexa Fluor 568 (использовались зонды Alexa Fluor и образец компании Molecular Probes и наблюдался с использованием трех комбинаций фильтров из таблицы 1: Blue GFP/DAPI, Endow GFP Bandpass, TRITC DsRed. Это изображение отчетливо демонстрирует возможности флуоресцентной стереомикроскопии на больших увеличениях при наблюдении образцов, приготовленных для сложных микроскопов.

Рис. 4. Срез почки мыши в свете флуоресценции

Другие производители стереомикроскопов предлагают альтернативные способы освещения для флуоресцентного возбуждения и наблюдения. В наиболее популярной конфигурации, представленной на рисунке 5, для флуоресцентного возбуждения используется внешняя схема, не использующая оптическую систему микроскопа для визуализации изображений. Свет из блока осветителя, сначала проходит через возбуждающий фильтр, и затем направляя через тубус, расположенный сзади корпуса микроскопа. В нижней части тубуса расположена система линз, направляющих свет возбуждения на образец. В такой конфигурации свет направляется прямо на образец при любом увеличении трансфокатора, обеспечивая тем самым одинаковую интенсивность флуоресцентного освещения и равномерный темный фон при любом значении увеличения.

Вторичное флуоресцентное излучение, испускаемое окрашенным образцом, захватывается общим главным объективом (рисунок 5) и проходит по каналам блока трансфокатора к пороговым фильтрам в верхней части микроскопа. После этого свет направляется либо к окулярам для прямого наблюдения, либо в тубус камеры для получения цифрового изображения или микрофотографирования. В этой конфигурации не нужны дихроичные зеркала, и это ее главное преимущество, другое преимущество - независимость от предварительно собранных блоков фильтров, что дает исследователю большую свободу выбора фильтров. Тем не менее, эта конфигурация может привести к ошибкам в работе неопытных операторов, вызванным неверным подбором комбинации фильтров.

Рис. 5. Микроскоп с отдельным ходом лучей света возбуждения

Интенсивное ультрафиолетовое излучение ртутной дуговой лампы, используемой в качестве источника света возбуждения во флуоресцентной микроскопии, может нанести серьезные повреждения сетчатки глаза. Во избежание этого, на корпусе микроскопов многих производителей есть защитные устройства, которые отфильтровывают ультрафиолетовый свет, облучающий образец на предметном столике. Другие меры предосторожности включают ультрафиолетовые пороговые фильтры на пути наблюдения и защиту от рассеянного света вокруг блока осветителя. В направляющие и поворотные рамки флуоресцентных интерференционных фильтров, если они не используются, часто вставляются специальные заглушки в форме фильтров.

Флуоресцентные стереомикроскопы часто оборудованы специальной диафрагмой, расположенной где-нибудь между блоком ртутного осветителя и вертикальным осветителем, для блокировки опасного ультрафиолетового излучения, исходящего от лампы, в то время, когда образец не наблюдается. Когда наблюдения не проводятся, эту диафрагму необходимо устанавливать на пути прохождения света.

При наблюдении образцов светосильными апохроматическими объективами (от 1.6x до 2.0x) во флуоресцентной стереомикроскопии, в нижних участках поля зрения могут возникать отблески, или горячие пятна. Этот артефакт обычно проявляется только при низких коэффициентах трансфокации, и исчезает с на больших увеличениях. В большинстве случаев отражения не возникают, если увеличение объектива мало (от 0,5х до 1,0х), независимо от оптической коррекции, и этот эффект обычно отсутствует у объективов с высокой числовой апертурой и низкой коррекцией (ахроматы или планахроматы).

Как показано в таблице 2, во флуоресцентной микроскопии существует много приложений, где применяются стереомикроскопы. Количество образцов, которые удобно наблюдать именно в этом режиме, весьма велико, и относятся они к широкому кругу дисциплин от биологии до промышленных производств.

Табл. 2. Приложения флуоресцентной стереомикроскопии

Область	Приложения - Анализ
Биология	Экспрессия генов, сортировка клеток, диссекция, процессы развития, исследования глаз и мускулов
Ботаника
Фармакология	Капиллярный поток, лекарства, природоохранные наблюдения
Гидрология	Качество воды, клеточные структуры и анализ мембран фильтров
Агрономия	Изучение семян, экспрессия генов и трансгенетика
Электроника	Паяльная паста, анализ эпоксидных смол, проверка покрытий, отбор полимеров для интегральных микросхем
Полупроводники	Загрязнение фоторезистами, наличие инородных частиц, производственный контроль
Полимеры	Наличие инородных частиц, пустот, гранул, неполимеризированных областей
Металлообработка	Трещины, поверхностные дефекты, загрязнения, сварка, анализ разрушений
Материалы	Трещины, сварка, карбоновые соединения, исследование ориентаций
Бумажное производство	Волокна, покрытия и включения
Судебная экспертиза	Текстильные волокна, жидкости организма, отпечатки пальцев, банкноты, подделки

Флуоресцентная стереомикроскопия обладает уникальным, в сравнении с классическим сложным микроскопом, свойством трехмерного наблюдения. В дополнение к этому, стереомикроскопы обладают большими рабочими расстояниями и глубиной поля, что обеспечивает более широкое панорамное поле зрения и более интенсивную флуоресценцию. Эти характеристики имеют огромное значение для исследователей, которым приходится работать с большими биологическими образцами и материалами, и для специалистов, ведущих подготовительную работу, как например, монтаж компонентов, производственный контроль электроники или резка. Поскольку для специальных приложений становятся доступными все более точные комбинации фильтров, применение флуоресценции в стереомикроскопии продолжает расти.