Yerinde floresan hibridizasyonu. Nükleik asitlerin yerinde hibridizasyonu Yöntem, floresan in situ hibridizasyonun kullanımına dayanmaktadır - FISH teknolojisi

Ders 4

kromozomların hibridizasyonu

giriiş

Tek tek genlerin kromozomlar üzerindeki lokalizasyonunu belirlemek için (yani, gen haritalaması), bütün bir cephanelik kullanılır. özel yöntemler. Ana olanlardan biri, bir genin veya onun fragmanının, hücrelerden izole edilmiş katı bir destek üzerine sabitlenmiş kromozom preparatları ile moleküler hibridizasyonudur (bir hibrit oluşumu). saf formu(buna yerinde hibridizasyon denir). Yerinde hibridizasyon yönteminin özü, kromozomlardaki denatüre (çözülmüş) DNA şeritleri ile tek sarmallı DNA veya RNA'nın (problar olarak adlandırılır) kromozom preparasyonuna eklenen tamamlayıcı nükleotid dizileri arasındaki etkileşimdir (hibridizasyon).

Floresan etiketli in situ hibridizasyon (FISH)

Bu yöntem, kromozomların morfolojisini incelemekten onları oluşturan DNA dizilerini analiz etmeye geçmeyi mümkün kıldı.FISH yöntemi, genlerin veya kromozomların intravital boyanması için flüoresan molekülleri kullanır. Yöntem, gen haritalaması ve kromozomal anormalliklerin tanımlanması için kullanılır.

Teknik, araştırma nesnesini temsil eden DNA dizilerini tamamlayıcı olan, prob adı verilen kısa DNA dizilerinin hazırlanmasıyla başlar. Problar, tamamlayıcı DNA bölgelerine hibritleşir (bağlanır) ve floresan bir etiketle etiketlenmiş olmaları nedeniyle, DNA veya kromozomlarda ilgili genlerin lokalizasyonunu görmenizi sağlar. Aktif hücre bölünmesi gerektiren kromozomları incelemeye yönelik diğer yöntemlerin aksine, FISH, bölünmeyen hücreler üzerinde gerçekleştirilebilir ve bu da yöntemi esnek hale getirir.

FISH kullanılarak çeşitli amaçlar için uygulanabilir. üç sonda çeşitli tipler:

• lokusa özgü problar kromozomların belirli bölgelerine bağlanır. Bu problar, etiketli bir prob hazırlamak ve bunun ardından bir dizi kromozom ile hibritleşmesini sağlamak için kullanılan, izole edilmiş DNA'nın mevcut kısa dizisini tanımlamak için kullanılır;
• alfaoid veya santromerik tekrar probları kromozomların sentromerik bölgelerinin tekrar eden dizileridir. Onların yardımıyla, her kromozom farklı bir renge boyanabilir, bu da kromozom sayısını ve normal sayılarından sapmaları hızlı bir şekilde belirlemenizi sağlar;
• tüm kromozom için problar kromozomun ayrı bölgelerini tamamlayan, ancak genel olarak tüm uzunluğunu kapsayan bir dizi küçük probtur. Bu tür problardan oluşan bir kitaplık kullanılarak, tüm kromozom "renklendirilebilir" ve bir bireyin diferansiyel spektral karyotipi elde edilebilir. Bu tür analiz, bir kromozomun bir parçası diğerinin koluna aktarıldığında translokasyonlar gibi kromozomal sapmaları analiz etmek için kullanılır.

Çalışma için materyal kan, kemik iliği, tümör biyopsisi, plasenta, fetal dokular veya amniyotik sıvıdır. Hem metafaz hem de interfaz hücre preparatları kullanılabilir. Floresan etiketlerle etiketlenmiş spesifik DNA probları, kromozomal DNA ile hibritlenir ve farklı lokuslarda aynı anda birden fazla prob kullanılabilir.

FISH, delesyonlar (mikrodelesyonlar dahil), translokasyonlar, ikiye katlanma ve anöploidi gibi kantitatif ve kalitatif kromozomal sapmaların saptanmasında yararlı ve hassas bir sitogenetik analiz yöntemidir. FISH, interfaz kromozomları üzerinde hizmet eder hızlı yöntem 21, 18 veya 13 kromozomda trizomi veya cinsiyet kromozomlarında anormalliklerin prenatal tanısı. Onkolojide FISH, hematolojik malignitelerle ilişkili bir dizi translokasyonu tespit edebilir. Yöntem, kemoterapi ve kemik iliği transplantasyonundan sonra kanserin kalan etkilerini izlemek ve bazı tümörler için kötü prognozla ilişkili gelişmiş onkogenleri belirlemek için de kullanılabilir. FISH ayrıca karşı cinsten bir bireyden elde edilen bir kemik iliği allogreftinin hayatta kalmasını izlemek için de kullanılır. FISH ayrıca bir doku numunesindeki spesifik mRNA'ları tespit etmek ve bulmak için de kullanılır. İkinci durumda, FISH yöntemi, hücrelerde ve dokularda gen ekspresyonunun uzay-zamansal özelliklerini oluşturmayı mümkün kılar.

FISH, kromozomal anormallikleri belirlemek ve büyük (>500) hücre sayılarını tek seferde hızlı ve hızlı analiz etmek için hassas bir yöntemdir. Yöntem, kromozomların doğasını ve kromozomal DNA'nın bilinmeyen parçalarını belirlemede oldukça doğrudur.

Böylece, Genel form FISH ayarı için protokol aşağıdaki gibi gösterilebilir:

1) Histolojik veya sitolojik bir preparatın hazırlanması

Histolojik bir preparasyonun hazırlanması standart şemaya göre gerçekleştirilir: kesme, işaretleme, kablolama, dökme, mikrotomi, kesiğin bir cam slayt üzerine yerleştirilmesi ve parafinden arındırma. Bir sitolojik preparat hazırlanırken, konsantre bir hücre süspansiyonu elde etmeyi mümkün kılan özel çöktürücü çözeltiler ve santrifüjleme kullanılır.

2) Ön işleme (gerekirse)

Preparasyon, hibridizasyonu engelleyen proteinlerin varlığını ortadan kaldırmak için proteazlar tarafından işlenir.

3) Preparasyona ve sonraki denatürasyona bir DNA probu uygulanması

Prob ve örnek DNA'yı denatüre etmek için formamid ile işlenir ve yaklaşık 85–90°C'lik bir sıcaklığa ısıtılır.

4) Hibridizasyon

Denatürasyondan sonra, ilaç belirli bir sıcaklığa soğutulur (durumda 37ºС). klinik araştırma) ve birkaç saat nemli bir odada inkübe edildi (inkübasyon süresi her özel protokolde belirtilmiştir). Şu anda, denatürasyon ve hibridizasyon için otomatik hibritleyiciler kullanılmaktadır.

5) Kızarma

Hibridizasyon tamamlandıktan sonra, bağlanmamış problar yıkanarak uzaklaştırılmalıdır, aksi takdirde FISH sonuçlarının değerlendirilmesini zorlaştıran bir arka plan oluşur. Yıkama için genellikle sitrat ve sodyum klorür (SSC) içeren bir çözelti kullanılır.

6) geri boyama

Floresan boyaların (DAPI - 4,6-diamidin-2-fenilindol; propidyum iyodür) yardımıyla tüm nükleer DNA boyanır.

7) Floresan mikroskop kullanarak sonuçların analizi

Çalışmanın ilk aşamalarında insan genomunun incelenmesi için özellikle önemli olan, adı verilen yöntemdi. somatik hücrelerin hibridizasyonu. Somatik (cinsiyet dışı) insan hücreleri diğer hayvan türlerinin hücreleriyle karıştırıldığında (çoğunlukla fare hücreleri veya Çin hamsteri bu amaçla kullanılmıştır), belirli ajanların varlığında çekirdekleri birleşebilir (melezleşme). Bu tür hibrit hücrelerin üremesi sırasında bazı kromozomlar kaybolur. Deney yapanların şansına, insan-fare hibrit hücreleri insan kromozomlarının çoğunu kaybeder. Daha sonra, yalnızca bir insan kromozomunun kaldığı melezler seçilir. Bu tür melezler üzerinde yapılan çalışmalar, bazı biyokimyasal özellikleri birbirine bağlamayı mümkün kıldı. hücresel insan, belirli insan kromozomları ile. Yavaş yavaş, seçici ortamların kullanımı yoluyla, belirli genleri taşıyan bireysel insan kromozomlarının korunmasını veya kaybını başarmayı öğrendiler.

Hücre füzyonunu kolaylaştırmak için farklı şekiller, Kültür ortamına UV ile inaktive edilmiş Sendai virüsü veya polietilen glikol eklenir. Orijinal insan ve fare hücrelerinden konfluent hücreleri seçmek için hücreler, yalnızca hibrit hücrelerin çoğalmasına izin veren özel bir seçici ortam üzerinde büyütülür.

Bugüne kadar kromojenik in situ hibridizasyon floresandan daha ekonomik bir yöntemdir. Floresan in situ hibridizasyon söz konusu olduğunda, DNA probu bir floresan etiketine konjuge edilir. Böyle bir çalışmanın sonuçları floresan mikroskop altında değerlendirilir. Kromojenik in situ hibridizasyon durumunda, DNA probu peroksidaz veya başka bir şey ile konjuge edilir ve bir kromojen ile boyanır. Bu durumda, sonuçlar geleneksel bir ışık mikroskobu altında değerlendirilir.

ü FISH Yönteminin Avantajları

Gibi önemli faydalar BALIK şu şekilde ayırt edilebilir:

1) fazlar arası çekirdeklerdeki genetik materyali inceleme olasılığı;

2) "evet / hayır" ilkesine göre nesnel sonuçlar elde etmek - bu nicel bir yöntemdir;

3) sonuçların nispeten basit yorumu;

4) yüksek çözünürlük.

ü FISH Yönteminin Dezavantajları

1) floresan boyalar hızla "solur";

2) Sonuçları analiz etmek için yüksek kaliteli bir floresan mikroskobu gereklidir.

FISH (floresans in situ hibridizasyon) kanser tanısında vazgeçilmez bir yöntemdir. Spesifik flüoresan probların yardımıyla bu yöntem, genomik yeniden düzenlemelerin varlığını belirlemeyi, yani tanıyı netleştirmeyi, prognozu netleştirmeyi ve özel duruma bağlı olarak uygun tedaviyi seçmeyi mümkün kılar. Öncelikle onkohematolojik hastalıklarda bu yaklaşım kullanılmaktadır. Önceden, bu amaçlar için geleneksel karyotipleme kullanılıyordu, ancak hastanın hücreleri kültürde belirgin bir büyüme göstermiyorsa, bu, bu yöntemle tanıyı ciddi şekilde zorlaştırır. Bu durumlarda, FISH kullanımı laboratuvar teşhis olanaklarını önemli ölçüde genişletir. Ek olarak, karmaşık kromozomal yeniden düzenlemelerin FISH kullanılarak yorumlanması daha kolaydır.

Laboratuvar, sentromerlere, kromozomların ve genlerin belirli bölgelerine yönelik problar kullanır. Translokasyonları aramak için iki renkli problar seçilir, öyle ki normalde genomun farklı bölümlerinde bulunan iki genin fragmanları yakınlardaysa, farklı renkteki iki sinyal - her probdan bir tane, farklı olan bir sinyalde birleşir. orijinal olanlardan ışık. Böylece, örneğin, çeşitli lösemi türleri arasında yaygın olan BCR-ABL translokasyonları saptanır. MLL, TEL ve RARa gibi genler, farklı dizilere sahip kimerik genler oluşturmak için yeniden düzenlenebilir. Bu durumda, genin farklı uçlarına iki prob yaklaştırılır. Gen sağlam ise müstahzarın her çekirdeğinde bir nokta, bozuksa farklı renklerde iki nokta olacaktır. Bu nedenle FISH, kromozomal translokasyonları tespit etmek için PCR'den daha esnek bir tekniktir. Prob, PCR'de kullanılan ve yaygın olsa da spesifik yeniden düzenlemeleri tanıyan oligonükleotitlerin aksine, başka bir kromozomun bir parçasının kırılmasının ve bağlanmasının herhangi bir spesifik bölgede tam olarak nasıl meydana geldiğine bakılmaksızın kromozom üzerinde oturacaktır.

FISH tarafından tespit edilen belirteçler paneli, kronik lenfoid lösemide prognozun değerlendirilmesine izin verir. 11q ve 17p delesyonları kötü bir prognoz ile ilişkilendirilirken, normal bir karyotip gibi bir 13q delesyonu olumlu bir prognoz ile ilişkilidir. 12. kromozomdaki trizomi vakası, orta düzeyde bir risk grubuna atfedilebilir.

Miyelom risk kategorisi ayrıca silme ve translokasyonların bir kombinasyonu ile ilişkilidir, t(4;14), t(14;16) translokasyonları ve 17p delesyonu kötü prognoz ile ilişkilidir. Bu tür teşhis çalışmaları, zenginleştirmeden sonra kırmızı kemik iliği biyopsileri üzerinde gerçekleştirilir. Kimerik EML4-ALK geninin oluşumunun eşlik ettiği hafif bir inversiyon, küçük hücreli dışı akciğer kanserinin karakteristiğidir. Kimerik genin ürünü, hedefe yönelik tedavinin hedefidir. Böyle bir yeniden düzenleme FISH yöntemi ile de tespit edilebilir. HER2 amplifikasyonu genellikle dolaylı bir işaretle değerlendirilir - bunun için immünohistokimya yöntemi kullanılarak ekspresyon seviyesindeki bir artış, ancak bazı ülkelerde bu amaçla FISH kullanılması veya en azından doğrulama için bu yöntemin kullanılması önerilir.

Floresan in situ hibridizasyon

Floresan hibridizasyonu yerinde veya FISH yöntemi (İng. floresan yerinde hibridizasyon - BALIK ) - belirli bir DNA dizisinin metafaz kromozomları veya interfaz çekirdekleri üzerindeki konumunu saptamak ve belirlemek için kullanılan bir sitogenetik yöntem yerinde. Ek olarak, bir doku numunesindeki spesifik mRNA'ları tespit etmek için FISH kullanılır. İkinci durumda, FISH yöntemi, hücrelerde ve dokularda gen ekspresyonunun uzay-zamansal özelliklerini oluşturmayı mümkün kılar.

Sondalar

Floresan hibridizasyon ile yerinde numunedeki tamamlayıcı hedeflere bağlanan DNA probları (DNA probları) kullanın. DNA probları, floroforlarla (doğrudan etiketleme) veya biyotin veya digoksigenin (dolaylı etiketleme) gibi konjugatlarla etiketlenmiş nükleositler içerir. Doğrudan etiketleme ile hedefe bağlı DNA probu, hibridizasyon tamamlandıktan hemen sonra bir flüoresan mikroskobu kullanılarak gözlemlenebilir. Dolaylı etiketleme durumunda, flüoresan etiketli avidin veya stepavidin kullanılarak biyotin ve flüoresan etiketli antikorlar kullanılarak digoksigenin saptandığı ek bir boyama prosedürü gerekir. DNA örneklerini etiketlemenin dolaylı versiyonu ek reaktifler ve zaman gerektirse de, bu yöntem genellikle bir antikor veya avidin molekülü üzerinde 3-4 florokrom molekülünün varlığı nedeniyle daha yüksek bir sinyal düzeyine ulaşır. Ek olarak, dolaylı etiketleme durumunda, sinyalin kademeli olarak yükseltilmesi mümkündür.

DNA örnekleri oluşturmak için klonlanmış DNA dizileri, genomik DNA, PCR reaksiyon ürünleri, işaretli oligonükleotidler ve mikrodiseksiyon ile elde edilen DNA kullanılır.

Probun etiketlenmesi çeşitli şekillerde gerçekleştirilebilir, örneğin nick-translasyon veya etiketlenmiş nükleotitlerle PCR.

Hibridizasyon prosedürü

Floresan hibridizasyon deneyinin şeması yerindeçekirdekteki genin konumunu belirlemek için

İlk adım, probların tasarımıdır. Prob boyutu, hibridizasyonun belirli bir bölgede meydana gelmesi için yeterince büyük olmalı, ancak hibridizasyon sürecini engellemeyecek şekilde çok büyük olmamalıdır (en fazla 1 kb). Spesifik lokusları tanımlarken veya tüm kromozomları boyarken, hibridizasyon karışımına etiketlenmemiş DNA tekrarları (örneğin, Cot-1 DNA) ekleyerek DNA problarının benzersiz olmayan tekrarlayan DNA dizileriyle hibridizasyonunu bloke etmek gerekir. DNA probu çift sarmallı DNA ise, hibridizasyondan önce denatüre edilmelidir.

Bir sonraki aşamada, interfaz çekirdeklerinin veya metafaz kromozomlarının hazırlıkları hazırlanır. Hücreler, genellikle bir cam slayt üzerinde bir substrat üzerine sabitlenir, ardından DNA denatürasyonu yapılır. Kromozomların veya çekirdeklerin morfolojisini korumak için denatürasyon, denatürasyon sıcaklığını 70°'ye düşürmeyi mümkün kılan formamid varlığında gerçekleştirilir.

Bağlı DNA problarının görselleştirilmesi, bir flüoresan mikroskop kullanılarak gerçekleştirilir. Floresan sinyalinin yoğunluğu birçok faktöre bağlıdır - probun etiketleme etkinliği, prob tipi ve floresan boya tipi.

Edebiyat

• Rubtsov N.B. Memeli kromozomlarıyla çalışma yöntemleri: Proc. ödenek / Novosib. durum un-t. Novosibirsk, 2006. 152 s.

• Rubtsov N.B. Nükleik asitlerin hibridizasyonu yerinde kromozomal anormalliklerin analizinde. "Moleküler teşhise giriş" kitabındaki bölüm Cilt 2. "Kalıtsal ve onkolojik hastalıkların teşhisinde moleküler genetik yöntemler" / Ed. MA Paltseva, D.V. Zaletaev. Tıp üniversitelerinin öğrencileri için eğitim literatürü. M.: Tıp, 2011. T. 2. S. 100–136.

notlar

Wikimedia Vakfı. 2010

Diğer sözlüklerde "Floresan in situ hibridizasyon" un ne olduğuna bakın:

Bu terimin başka anlamları vardır, bkz. hibritleşme. DNA hibridizasyonu, nükleik asitlerin in vitro hibridizasyonu, tamamlayıcı tek zincirli nükleik asitlerin tek bir molekül halinde kombinasyonu. Tam bir tamamlayıcılıkla ... ... Wikipedia

Yerinde hibridizasyon yetenekleri, birden fazla flüoresan rengin eşzamanlı kullanımıyla büyük ölçüde geliştirilebilir. En basit haliyle çok renkli floresan in situ hibridizasyon (FISH), hibridizasyonda farklı floroforlar kullanıldığından birçok özelliği etiketlemek (lekelemek) için kullanılabilir. Dijital görüntüleme mikroskopları, tek renkler yerine renk kombinasyonlarını kullanarak, tek tek hücrelerde boyayla ifade edilen çok daha fazla özelliği aynı anda saptayabilir.

Pirinç. 1. Çok Renkli BALIK

Dünyanın önde gelen optik sistem ve ilgili ekipman üreticilerinin floresan mikroskoplarını ayrıntılı olarak tanımak için kataloğumuzu ziyaret edin veya uzmanlarımızla iletişime geçin ve tüm sorularınız için tam bir profesyonel danışmanlık alın.

Şekil 1, tipik bir çok renkli flüoresan hibritleşmeyi gösterir - FISH modeli. Normal erkek lenfositleri, Chr2l ve ChrY probları ile boyanmış FITC-biyotin ve Chrl3 ve ChrY probları ile boyanmış CY3-digoksigenin ile hibritlenmiştir. Sol üst - DAPI filtresiyle elde edilen DAPI lekeli DNA çekirdekleri. Sağ üst, bir FITC filtresiyle elde edilen Chr2l ve ChrY'nin FITC ile boyanmış bir görüntüsüdür. Sol alt - CY3 filtresi kullanılarak elde edilen, CY3 ile boyanmış Chrl3 ve ChrY. Sağ alttaki görüntü, tüm hedef kromozomları renkli olarak gösteren bileşik bir görüntüdür. Bu örnek Dr. Tim Housel, Integrated Genetics, Framingham, Massachusetts tarafından sağlanmıştır.

Dijital görüntüleme teknikleriyle birleştirilmiş çok renkli FISH tekniği artık hücre bileşenlerinin, kromozomların ve genlerin analizi için çoklu nükleik asit dizilerinin benzersiz izotopik olmayan tespitini sunuyor.

Floresan - kimyasal bir bileşiğin ışığın bir dalga boyunda uyarıldığı ve diğerinde, genellikle daha uzun süre yaydığı bir fenomen - tüm biyolojik bilimlerde çeşitli yapıları ve hücre içi süreçleri incelemek için kullanılır. Boyaların ve mikroskopların geliştirilmesindeki teknolojik gelişmeler, son on yılda floresans tekniklerinin hızla gelişmesine yol açmıştır.

Bu gözden geçirme makalesi, FISH yönteminin temellerini, araştırmacıların FISH yıllarında karşılaştığı kısıtlamaları, bu yöntemin gelişimini etkileyen donanım, yazılım, boyalar ve reaktiflerdeki son gelişmeleri ve bu alandaki güncel eğilimleri ana hatlarıyla açıklayacaktır. Sadece araştırma laboratuvarlarında değil, klinik teşhiste de kullanılmasına yol açan bu yöntemin en son başarıları da bu makalede ele alınacaktır.

FISH yöntemine genel bakış

FISH uygulaması genomik, sitogenetik, doğum öncesi araştırma, neoplazm biyolojisi, radyoaktif etiketleme, gen haritalama, gen amplifikasyonu ve temel biyomedikal araştırmalarda hızla artmaktadır. Prensip olarak, bu yöntem oldukça basittir.

Hibridizasyon, konumlarının ve boyutlarının gözlemlenebilmesi için hedef genomik dizileri tanımlar veya işaretler. Kromozoma bağlı olarak uygun DNA veya RNA dizileri, önce raportör gruplarla etiketlenir, bunlar daha sonra floresan mikroskopisi kullanılarak tanımlanır. Etiketli DNA veya RNA probu daha sonra bir cam slayt üzerinde metafaz kromozomlarına veya dinlenme çekirdeklerine hibridize edilir. Sinyali yıkadıktan ve yükselttikten sonra, numune, floresan mikroskobu kullanılarak raportör grupları için incelenir.

FISH, morfolojik ve genomik yapıların çok yüksek uzamsal çözünürlüğünü elde etmeyi mümkün kılar. Bu yöntem oldukça hızlıdır, uygulanması kolaydır ve yüksek boya stabilitesi ile karakterize edilir. Kullanılan proba bağlı olarak, bir bireyin genomunu, tüm kromozomları, kromozom bölümlerini ve benzersiz kopya dizilerini belirlemek mümkündür.

Eski kısıtlamalar

Yakın zamana kadar FISH, donanım, yazılım, reaktifler, boya teknolojisi ve yüksek yürütme maliyetleri ile sınırlıydı. Çok renkli FISH için optimize edilmiş ticari olarak temin edilebilen mikroskop donanımı 1990'ların ortalarına kadar mevcut değildi. Bundan önce, mikroskopların FISH uygulamaları için özel olarak yapılandırılması gerekiyordu. Çoğu mikroskobik optik, FISH'e özgü düşük seviyeli ışık sinyallerini algılamak için tasarlanmamıştı. Bu yöntem kullanılarak genomların çözünürlüğü önemli ölçüde iyileştirildiğinden, mikroskobik optiklere olan gereksinimler de arttı. Birçok dalga boyundaki renk sapmaları da bir sorun teşkil ediyordu. Özellikle çok renkli analiz için, yakınsak mercek dahil tüm merceklerin renk sapmalarına karşı düzeltilmesi gerekiyordu. Ek olarak, tekdüze bir aydınlatma elde etmek için epifloresan ışıkları ayarlamak çok zordu.

Çok renkli FISH görüntülerinin analizi, çeşitli sinyallerin (a) ayrı filtre küpleriyle veya (b) geniş bant dikroik ve eşik filtreli bir uyarım filtre dizisi kullanılarak ayrılmasını gerektirir. Filtre teknolojisinin geliştirilmesi, bireysel filtre küpleri arasında mekanik geçişin neden olduğu optik yanlış hizalama ve yanlış hizalamanın neden olduğu önceki sorunlardan bazılarını düzeltmiştir. Çok bantlı dikroik ve eşik filtrelerle birlikte kullanılan değiştirilebilir uyarım filtreleri, her renk için ayrı uyartım filtreleri kullanarak bir kayma tespit etmeden üç renkle etkili bir şekilde çalışabilir. Ancak üçten fazla renkle çalışırken yine de tek bantlı filtreler kullanmanız gerekir.

Veri toplama için yüksek hızlı renkli film veya CCD (Charge-Coupled Device) kullanıldı ve her iki durumda da renk doğruluğu ile ilgili sorunlar yaşandı. Ayrıca, farklı boya probları kullanılarak aynı numuneden alınan farklı renkteki görüntülerin üst üste binmesiyle ilgili sorunlar vardı.

Mevcut görüntü analiz sistemleri flüoresan numune numuneleriyle çalışmak için optimize edilmediğinden, flüoresan reaktiflerle hazırlanan numunelerin kantitatif analizine yönelik yazılım da arzulanan çok şey bıraktı. Görsel analiz, zaman alıcı ve genellikle öznel bir prosedürdür, bu nedenle, gelişmiş floresan görüntüleme kullanılmadan, floresan numunelerin analizi zor ve belirsizdi. Araştırmacıların, görüntü analizi için kendi programlarını geliştirmeleri için genellikle kadrolarında kendi programcılarının olması gerekiyordu.

Reaktifler ve boyalar tek başına tüm uygulamalar için yetersizdi. Örneğin, hibridizasyon yerini belirlemenin etkinliği azalan prob boyutuyla birlikte azaldı, bu da floresan mikroskobu ile gözlemlenebilen numuneleri ciddi şekilde sınırladı. Farklı flüoresan boyaların sayısı sınırlıydı; ek olarak, düşük fotostabiliteye sahiptiler. Ancak federal olarak finanse edilen İnsan Genomu Projesi kapsamında floresan boya teknolojisi ve ilgili teknolojilerin geliştirilmesi şu anda meyvelerini veriyor. Tüm insan kromozomları için problar zaten mevcuttur ve mevcut gen problarının sayısı da artmaktadır. Yerinde hibridizasyon kitleri ve flüoresan etiketli problar artık birkaç şirketten ticari olarak temin edilebilir.

Fiyat bir başka büyük engeldi. Piyasada ticari olarak bulunabilen FISH sistemleri olmadığı için araştırmacılar, reaktifler, problar, mikroskop, görüntüleme, veri analizi ve raporlama donanımı ve yazılımı dahil olmak üzere ısmarlama sistemler kurmak zorunda kaldılar. Karmaşık görüntü analiziyle çok renkli FISH yapmak, araştırmacıya 200.000 dolardan fazlaya mal olabilir; bu, çoğu klinik araştırmacı için ulaşılması zor bir miktardır. Sonuç olarak, FISH'i laboratuvarlarında kullanmak isteyen birçok araştırmacı bunu gerçekleştirememiştir.

FISH yaygın olarak bulunur hale geldi

Birçok donanım ve yazılım üreticisi, özel sistemlere alternatif olarak uygun fiyatlı hazır sistemler geliştirmiştir. FISH ile ilgili birçok firma ve laboratuvar arasında gelişen işbirliği ortamı, bu alanda yeni atılımlara yol açmıştır. Ve yayınlanan eserlerin yazarları, başarılarını tam olarak bu tür bir işbirliği çerçevesinde görüyorlar.

Pirinç. 2. MultiFluor çalıştırma ekranı

Amerika Birleşik Devletleri'nde faaliyet gösteren ve piyasada bulunan FISH araştırma sistemleri için orta sınıf fiyatlar sağlayan sistem, birçok üreticinin bileşenlerini entegre eder ve görüntü işleme yazılımı, mikroskop donanımı ve diğer aksesuarlardaki en son gelişmelere dayanır. Klinik araştırma laboratuvarları için bu sistemin birçok uygulamada yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Entegre ve otomatik olması, klinik deneyleri tam olarak yürütmenize olanak tanır.

Burada sunulan yazılım sistemi, çok renkli FISH örneklerinden elde edilen yapısal ve moleküler özelliklerin tespiti, analizi ve sunumu için Microsoft® Windows (Microsoft Corporation, Bellevue, Washington) üzerinde geliştirilmiş çok parametreli bir görüntüleme sistemi (Biology Research Systems) olan MultiFluor™'dur. . Analiz süresi ve sonuçların doğruluğu, her numunede farklı dalga boylarında birçok özelliği ilişkilendirerek iyileştirilir. Bu sistem, görüntü elde etmeyi, depolamayı, veri tabanı yönetimini, otomatik mikroskop kontrolünü ve tam özellikli grafik veri analizini kolaylaştırır.

Şekil 2, MultiFluor verilerine genel bakış ekranını göstermektedir. Kullanıcılar, görüntüleri ve bunlarla ilişkili verileri görüntüleyebilir ve farklı renklerde (farklı dalga boylarında) elde edilen çok parametreli verileri, histogramlar, dağılım grafikleri vb. dahil olmak üzere çeşitli çizim araçlarını kullanarak karşılaştırabilir. renkli hücre görüntüleri (DAPI çekirdeklerini, FITC-ChrX, CY3-ChrY ve CY5-Chr2l'yi gösteren), tabloda sunulan temel verilerle birlikte.

FISH araştırmacıları, farklı odak düzlemlerinde farklı dalga boylarında görüntüleri otomatik olarak alma, çok renkli FISH problarını görselleştirme, görüntülere açıklama ekleme ve yazdırma, büyük miktarlarda çok renkli görüntü veri kümelerini depolama ve alma yeteneğine sahiptir. Çok renkli FISH metafaz kromozomları, gen haritalaması, karşılaştırmalı genomik hibridizasyon (CGH) ve karyotip üretimi ile analiz edilebilir. Numunenin kullanıcı tarafından seçilen alanları taranabilir ve analiz edilebilir. Yazılım, sistemi otomatik olarak odaklar, çoklu dalga boylarında görüntüler alır, cam bir slayt üzerindeki hücrelerin konumunu hatırlar ve prob sayısı, floresan yoğunluğu ve hücre morfometrisi gibi çeşitli özellikleri ölçer. Farklı dalga boylarındaki farklı özellikler birbiriyle ilişkilendirilebilir.

Sistemin ek bir özelliği, bir ağa bağlı kişisel bilgisayarlarla (PC'ler) çalışabilmesidir. Tipik bir yapılandırmada, bir bilgisayar, kamera ve mikroskop donanımına bağlı bir çevrimiçi istasyondur. Bu bilgisayar, görüntülerin alınmasını kontrol eder ve anında analiz gerçekleştirir. Diğer PC'ler, bilgi analizi için birinci PC'den alınan verilerin işlendiği veya bazı özel analizlerin otonom olarak gerçekleştirildiği ikincil istasyonlardır.

Program, eşzamanlı çok renkli görselleştirme için tüm bileşenleri parlak sözde renklerde sunmanıza olanak tanır. Örneğin, dört renkli bir deneyin eş zamanlı görüntüleri (DAPI (mavi), FITC (yeşil), CY3 (kırmızı) ve FITC-CY3 (sarı) kombinasyonu kullanılarak) ayrı ayrı sunulabilir veya tek bir görüntüde birleştirilebilir (olduğu gibi) Şekil 1'de gösterilmiştir) . Her görüntü, ilgilenilen özellikleri vurgulamak için etkileşimli olarak geliştirilebilir. Programı kullanarak histogramlar, dağılım grafikleri, tablolar, çizgi grafikler ve diğer veri sunum ve değerlendirme biçimlerini oluşturmak kolaydır (Şekil 2). Ek olarak, veriler TIFF, JPEG, GIF ve diğerleri gibi kolay erişilebilir ve popüler formatlarda saklanır.

Onkolojik, doğum öncesi ve biyolojik araştırma

FISH tarafından açıklanan sistemler, araştırmacılar için önceki ısmarlama sistemlerden daha erişilebilir olacak şekilde tasarlanmıştır. Onkoloji, patoloji, sitogenetik ve gelişim biyolojisinde giderek daha fazla kullanılmaktadırlar. Uygulamaları arasında çok renkli boyalarla gözlemlenen leke sayısına göre fazlar arası hücrelerin analizi, immünofenotipleme, hücre morfometrisi ve DNA bileşimi yer alır.

Bu sistemler, tümörlerin oluşumu ile ilişkili olan, DNA'nın toplam bileşimi ile ilişkili olan kromozom kopyalarının sayısındaki anormallikleri analiz eder. Mesane. Doğum öncesi araştırmalarda bu sistemler, Down sendromu, Turner sendromu, Klinefelter sendromu ve diğerleri dahil olmak üzere doğum öncesi kusurlarla ilişkili dinlenme çekirdeklerindeki anöploidileri tespit etmek için kullanılabilir. Hücre ve gelişim biyolojisinde bu sistem, hücre yüzeyi belirteçlerini ve bunların reseptörler, hücre iskeleti proteinleri, haberci RNA'lar ve spesifik genler dahil olmak üzere sitoplazmik belirteçler gibi göreli dağılımlarını haritalamak için kullanılabilir.

Teşhis potansiyeli

Son on beş yılda, FISH yönteminin yalnızca araştırma çalışmalarında bir araç olarak değil, aynı zamanda prenatal tanı, sitogenetik ve tümör gelişimi gibi alanlarda klinik teşhiste de muazzam bir potansiyele sahip olduğu ortaya çıktı. Yüksek kaliteli, uygun maliyetli sistemlerin olmaması, FISH'in araştırmacılar arasında yayılmasını engellemekle kalmadı, aynı zamanda birçok tıp kurumunun tanı merkezleri için bu yöntemi ulaşılamaz hale getirdi.

Daha önce sadece pahalı, özel yapım ekipmanlarla elde edilebilen sonuçlar, artık bu sistemle de alınabiliyor - ve bu, sistemin en önemli avantajlarından biri. FISH'i yalnızca daha geniş bir biyomedikal araştırma yelpazesine değil, doğrudan hastaların hizmetine sunma hayali de çok uzak olmayan bir gelecekte gerçek olabilir.

Floresan stereomikroskopi

epifloresan aydınlatma

Yakın zamana kadar, flüoresan aydınlatma yalnızca özel yüksek açıklıklı objektiflerle donatılmış araştırma mikroskoplarında mevcuttu. Bu teknikte stereomikroskopiye olan ihtiyaç, GFP (Yeşil Floresan Protein) gibi genetik olarak kodlanmış ve biyolojik olarak spesifik floresan proteinlerin ortaya çıkmasıyla artmıştır.

Pirinç. 1. Epifloresan aydınlatıcılı stereomikroskop

GFP gözlemi için stereo mikroskopların kullanımı o kadar yaygındır ki, hem yaşam bilimleri hem de elektronik endüstrisinde birçok başka uygulamada kullanılabilmelerine rağmen, stereo floresan aydınlatıcılara daha yaygın olarak GFP aydınlatıcılar denir. Larvalar, nematodlar, zebra balığı, oositler ve olgun böcekler gibi büyük numuneler, GFP ile boyandığında ve flüoresan ışıkla aydınlatıldığında gözlemlenmesi (ve manipüle edilmesi) kolaydır. Floresan aydınlatma, hangi organizmaların floresan proteini ürettiğini ortaya çıkarır ve stereoskopik gözlem, geniş bir görüş alanı ve uzun çalışma mesafesi ile birleştiğinde, gözlemcinin deney sırasında cımbız, pipet veya mikromanipülatör kullanmasına olanak tanır. Diğer, daha tipik örneklerin de flüoresan aydınlatmalı stereomikroskoplar kullanılarak incelenmesi kolaydır.

Bir stereomikroskop üzerindeki epifloresan aydınlatıcı, daha karmaşık mikroskoplarda bulunanlara benzer şekilde çalışır. Tipik olarak, flüoresan aydınlatıcı, mikroskop zumu ve oküler tüpleri arasına yerleştirilmiş bir ara tüp (veya dikey aydınlatıcı, bkz. Bugüne kadar, bu tür bir aydınlatma, yaygın lens (CMO) stereo mikroskop uygulamalarıyla sınırlıdır çünkü piyasada bulunan parçalar, bir Grenoux stereo mikroskobunu veya diğer yakınsak stereo mikroskobu floresan ışığına ayarlamak için kullanılamaz.

Ark lambası tarafından yayılan ışık, ayarlanabilir bir yakınsak toplayıcı merceğin içinden kombinasyon filtre bloğunda bulunan bir uyarma filtresine yönlendirilir (Şekil 2 ve 3'te gösterildiği gibi). Bu filtre ışığı yalnızca belirli bir dalga aralığında (bant genişliği) iletir. Filtreden geçen ışık daha sonra mikroskobun optik yolu boyunca alt kısmına (zoom modülü ve stereo mikroskopta objektif) saptırılır ve ayara bağlı olarak yansıtan bir dikroik ayna tarafından numuneye yönlendirilir. , belirli uzunluktaki ışığı seçici olarak filtreler ve/veya iletir, spektrumun dalgaları/bölgeleri. Dikroik (veya dikromatik) terimi, bir filtrenin veya aynanın, belirli bir dalga boyu sınırının altına düşen bir rengin ışığını yansıtarak ve bu sınırın üzerindeki renkleri ileterek gelen ışığın renklerini "ayırt etme" özelliğini ifade eder.

Pirinç. 2. Floresan stereomikroskopta ışınların yolu

Odaklanmış uyarma ışığı huzmesi zum ve mercek içinden geçer ve burada numuneyi ışınlayan ters bir ışık konisi oluşturur ve numunedeki tüm floroforların uyarılmasına neden olur, absorpsiyon bandı ışınlayan ışığın iletim bandına karşılık gelir. Numuneden yayılan ikincil flüoresan ışık (tipik olarak uyarma dalga boyundan daha uzun) stereomikroskopun ortak ana hedefi tarafından yakalanır ve yakınlaştırma aracılığıyla uyarma dalga boyunda ışığı bloke eden ve emisyonda yalnızca ışığa izin veren bir eşik filtresine yönlendirilir. geçmek için dalga boyu. Şekil 1 ve 2'deki mikroskop tüpü, yakınlaştırmanın sol ve sağ optik kanallarından geri geçen daha uzun floresan emisyon dalga boylarının epifloresan aydınlatıcıya ulaşmadan önce bağımsız olarak odaklanacağı şekilde tasarlanmıştır. Sol kanaldan gelen ışık doğrudan eşik filtresine geçer, ardından oküler tüplerine veya fotoporta yönlendirilir. Buna karşılık, sağ kanaldaki ışık önce dikroik aynadan geri, ardından eşik filtresi ve okülerlere yönlendirilir. Bu ışığın kamera bağlantı noktasına çıkışı yoktur ve yalnızca numune gözlemi için kullanılabilir.

Flüoresan kombine filtre bankasının yapı detayları Şekil 2 ve 3'te gösterilmektedir. Her banka, tek bantlı bir uyarma ışık filtresi, iki eşik filtresi ve bir dikroik ayna içerir. Cıva ark lambasından gelen ışık uyarma filtresi yoluyla filtre bloğuna girer ve yukarıda tartışıldığı ve Şekil 3'te gösterildiği gibi dikroik aynanın yüzeyinden yansıtılır. İkincil flüoresan radyasyon eşik filtrelerinden geçer. Sol kanalın uyartım filtresi, dikroik aynası ve eşik filtresi sisteme yapıştırılmıştır ve sağ kanalın eşik filtresi, sabitleme vidaları gevşetilerek bloktan çıkarılabilen küçük bir çerçeveye sabitlenmiştir. Eşik filtresini kaldırarak, filtre ünitesinin içinde bulunan dikroik aynaya erişebilirsiniz. Yedek filtreleri takarken, filtrelerin yüzeyine yapışkan bulaşmamasına dikkat edin ve parmak izlerinin yüzeye bulaşmasını önlemek için filtreleri ve dikroik aynayı tutmadan önce eldiven giydiğinizden emin olun.

Floresan dikey aydınlatıcı, normal parlak alan gözlemi için üç filtre bankası ve boş bir dia-filtre bankası (filtresiz) barındırabilir. Filtre üniteleri raylar üzerine monte edilmiş ve rayların pozisyonunu kontrol etmek için kullanılan bir kol ile optik yolda konumlandırılmıştır. Her birim, eşleşen bir tanımlama plakası ile birlikte gelir. Operatörün floresan gözlemi için doğru filtre ünitesini kolayca seçebilmesi için etiketler aydınlatıcı gövdesindeki yuvaya sıralı bir şekilde yerleştirilir.

Pirinç. 3. Bir stereomikroskopta floresan filtrelerin kombinasyonları

Tablo 1'de bir dizi filtre kombinasyonu gösterilmektedir. Bu filtreler, çok çeşitli flüoresan uyarımı ve emisyonunu kapsar ve geleneksel flüoresan boyaları kullanan birçok biyolojik çalışmada faydalı olmalıdır. Bu filtre kombinasyonları, fotodirençlerin floresan polimer kontaminasyonu için IC gofretlerinin analizi gibi endüstriyel uygulamalar için de uygundur. Uygun bir uyarma/emisyon filtresi kombinasyonu seçilerek, uyarma dalga boyları 380 ila 510 nanometre aralığında olan flüoresan problar kullanılabilir (bkz. Tablo 1). Bu filtre kombinasyonları, cam göbeği ve mavi çeşitleri dahil olmak üzere çeşitli yeşil flüoresan protein mutantlarıyla yapılan çalışmalarda da çok faydalıdır.

Florasan etiketli proteinlere sahip canlı hücre kültürlerinde, filtre kombinasyonları floroforların uyarma ve emisyon profiliyle tam olarak eşleşirse sinyal yoğunluğu önemli ölçüde artırılabilir. Örneğin, DS-kırmızı sinyaller söz konusu olduğunda, fotodedektörler tarafından kırmızı flüoresanın görsel olarak gözlemlenmesi ve görüntülenmesi, kırmızı sinyali daha fazla turuncu ışık yaymaya doğru kaydırarak büyük ölçüde geliştirilebilir. Ek olarak, yoğun klorofil arka plan otofloresanına sahip bitki örneklerine göre uyarlanmış filtre kombinasyonları, uygun filtre ve emisyon sinyali spesifikasyonlarıyla uygun şekilde eşleştirildiğinde genellikle daha etkilidir. Bu kriterlerin çoğu, çeşitli stereomikroskop filtre kombinasyonlarının bant genişliğini optimize etmek için mikroskop tasarım mühendisleri tarafından dikkate alınır.

Sekme 1. Stereomikroskopların flüoresan filtrelerinin kombinasyonları

Filtre kiti	Uyarma dalga boyu aralığı	dikroik ayna	Emisyon dalga boyu aralığı
Mavi GFP/DAPI
Mavi (EGFP) GFP
GFP Bant Genişliği
Genişletilmiş GFP Bant Genişliği
TRITC (Ds-kırmızı)
Sarı GFP Bant Genişliği

Tüm hassas girişim filtreleri gibi kombi kutu filtreler de yoğun ışık ve ultraviyole maruz kalma nedeniyle sonunda başarısız olur. Bant genişliği ve geçirgenlik gibi özellikler de filtreler kullanıldığında ve nemli bir ortamda saklandığında değişir. Daha uzun ömür için, bu filtreler bir kurutucu ile bir fırında veya sızdırmaz bir kapta saklanmalıdır. Gözlem yapılmadığında, filtrelerden geçen ışık miktarını azaltmak için aydınlatıcı kapağı kapalı tutulmalıdır. Filtre yalnızca bir teneke kutudan alınan kuru hava, yumuşak deve tüyü fırçası veya bir gaz şişesinden alınan yağsız gazla temizlenebilir. Çizilmeleri ve aşınmaları önlemek için, yumuşak girişim kaplamalı filtrelere sahip filtreleri asla bir mercek temizleme beziyle silmeyin.

Ark lambalarının odaklanması ve hizalanması

Bir flüoresan mikroskopta tüm lamba hizalama sürecini simüle eden bu Mercury veya Xenon Brülör etkileşimli öğreticisiyle ark lambalarını hizalama ve odaklama konusunda uygulamalı deneyim kazanın.

Stereomikroskoplar kullanılarak, floresan ışığı altında çeşitli numuneler gözlemlenebilir. 0,5x ila 1,6x'lik bir objektif büyütme ve 15x'e kadar bir yakınlaştırma aralığı ile bu stereo mikroskoplar, klasik bileşik mikroskopların görüntüleme aralığıyla karşılaştırılabilir olan 4x ila 540x'lik bir toplam sistem büyütmesi sağlayabilir. Geniş büyütme aralığı, mikroskop uzmanlarının cam bir lam üzerine yerleştirilmiş florokromlarla boyanmış ince kesitlerde hem büyük canlı örnekleri hem de ince ayrıntıları gözlemlemesine olanak tanır. Yüksek büyütmeli flüoresan gözleminin bir örneği Şekil 4'te gösterilmektedir. Üç işaretli lekeli kalın bir fare böbreğini göstermektedir. Numune DAPI, Alexa Fluor 488 WGA ve Alexa Fluor 568 (Alexa Fluor probları ve Molecular Probes numunesi kullanılarak) ile boyandı ve Tablo 1'deki üç filtre kombinasyonu kullanılarak gözlemlendi: Blue GFP/DAPI, Endow GFP Bandpass, TRITC DsRed. Bu görüntü net bir şekilde karmaşık mikroskoplar için hazırlanan numuneleri gözlemlerken yüksek büyütmelerde floresan stereomikroskopinin olanaklarını gösterir.

Pirinç. 4. Bir fare böbreğinin floresan ışığı altında kesiti

Diğer stereo mikroskop üreticileri, flüoresan uyarma ve gözlem için alternatif aydınlatma yöntemleri sunar. Şekil 5'te gösterilen en popüler yapılandırma, görüntüleme mikroskobunun optik sistemini kullanmayan floresan uyarma için harici bir devre kullanır. Aydınlatıcıdan gelen ışık önce bir uyarma filtresinden ve ardından mikroskop gövdesinin arkasında bulunan bir tüpten geçer. Tüpün alt kısmında, uyarma ışığını numuneye yönlendiren bir mercek sistemi bulunur. Bu konfigürasyonda ışık, herhangi bir yakınlaştırma büyütmesinde doğrudan örneğe yönlendirilir, böylece herhangi bir büyütmede aynı flüoresan aydınlatma yoğunluğu ve tekdüze bir karanlık arka plan sağlanır.

Boyanmış numune tarafından yayılan ikincil flüoresan ışık, ortak birincil hedef (Şekil 5) tarafından yakalanır ve yakınlaştırma bloğunun kanallarından mikroskobun tepesindeki eşik filtrelerine geçirilir. Işık daha sonra doğrudan gözlem için okülerlere veya dijital görüntüleme veya fotomikrografi için kamera tüpüne yönlendirilir. Bu konfigürasyon dikroik aynalara ihtiyaç duymaz ve bu onun ana avantajıdır, başka bir avantajı da araştırmacıya filtre seçiminde daha fazla özgürlük sağlayan önceden monte edilmiş filtre kümelerinden bağımsızlıktır. Ancak bu yapılandırma, yanlış filtre kombinasyonu nedeniyle deneyimsiz operatörler için hatalara yol açabilir.

Pirinç. 5. Ayrı uyarma ışık demetleri yoluna sahip mikroskop

Floresans mikroskobunda uyarma ışık kaynağı olarak kullanılan bir cıva ark lambasından çıkan yoğun ultraviyole radyasyon, retinada ciddi hasara neden olabilir. Bunu önlemek için, birçok mikroskop üreticisi, sahnede numuneyi ışınlayan ultraviyole ışığı filtreleyen vücut üzerinde koruyucu cihazlara sahiptir. Diğer önlemler arasında görüntüleme yolundaki ultraviyole kesme filtreleri ve aydınlatıcı ünitesinin etrafındaki kaçak ışık koruması yer alır. Floresan girişim filtresi kılavuzları ve döner çerçeveler, kullanılmadıklarında genellikle içlerine takılı filtre şeklindeki tapalara sahiptir.

Floresan stereomikroskoplar, numune gözlemlenmediğinde lambadan gelen tehlikeli ultraviyole radyasyonu engellemek için genellikle cıvalı aydınlatıcı ünite ile dikey aydınlatıcı arasında bir yere yerleştirilmiş özel bir diyaframla donatılmıştır. Gözlem yapılmadığında bu diyafram ışık yoluna yerleştirilmelidir.

Örnekler floresan stereomikroskopide hızlı apokromatik objektiflerle (1,6x ila 2,0x) gözlendiğinde, görüş alanının alt kısımlarında yansımalar veya sıcak noktalar oluşabilir. Bu artefakt genellikle yalnızca düşük yakınlaştırma oranlarında görünür ve yüksek büyütme oranlarında kaybolur. Çoğu durumda, optik düzeltmeden bağımsız olarak objektif büyütme düşükse (0,5x ile 1,0x arasında) yansımalar oluşmaz ve bu etki genellikle yüksek sayısal açıklık ve düşük düzeltme hedeflerinde (kromatlar veya plan akromatlar) yoktur.

Tablo 2'de gösterildiği gibi, floresan mikroskobunda stereomikroskopların kullanıldığı birçok uygulama vardır. Bu modda rahatlıkla gözlemlenebilen örnek sayısı çok fazladır ve bunlar biyolojiden endüstriyel üretime kadar geniş bir disiplin yelpazesine aittir.

Sekme 2. Floresan stereomikroskopi uygulamaları

Bölge	Uygulamalar - Analiz
Biyoloji	Gen ekspresyonu, hücre sıralama, diseksiyon, gelişimsel süreçler, göz ve kas çalışmaları
Botanik
Farmakoloji	Kılcal akış, ilaçlar, çevresel gözlemler
hidroloji	Su kalitesi, hücre yapıları ve filtre membranlarının analizi
Tarım bilimi	Tohum çalışmaları, gen ekspresyonu ve transgenetik
Elektronik	Lehim pastası, epoksi analizi, kaplama testi, entegre devreler için polimer seçimi
yarı iletkenler	Fotodirenç kontaminasyonu, yabancı parçacıklar, üretim kontrolü
polimerler	Yabancı parçacıkların, boşlukların, granüllerin, polimerize olmayan alanların varlığı
metal işleme	Çatlaklar, yüzey kusurları, kirlenme, kaynak, kırılma analizi
malzemeler	Çatlaklar, Kaynak, Karbon Ekler, Oryantasyon Çalışmaları
kağıt üretimi	Elyaflar, kaplamalar ve kapanımlar
adli muayene	Tekstil lifleri, vücut sıvıları, parmak izleri, banknotlar, sahteler

Floresan stereomikroskopi, klasik bileşik mikroskopla karşılaştırıldığında benzersiz bir üç boyutlu gözlem özelliğine sahiptir. Ek olarak, stereo mikroskoplar daha geniş çalışma mesafeleri ve alan derinliği sunarak daha geniş bir panoramik görüş alanı ve daha yoğun flüoresan sağlar. Bu özellikler, büyük biyolojik numuneler ve malzemelerle çalışmak zorunda olan araştırmacılar ve bileşen montajı, elektronik üretim kontrolü veya kesme gibi hazırlık işleriyle uğraşan profesyoneller için büyük önem taşır. Özel uygulamalar için giderek daha hassas filtre kombinasyonları kullanılabilir hale geldikçe, stereomikroskopide floresan kullanımı artmaya devam ediyor.