Fluorestseeruv hübridisatsioon in situ. Nukleiinhapete in situ hübridisatsioon Meetod põhineb fluorestsents in situ hübridisatsiooni kasutamisel – FISH tehnoloogia

4. loeng

Kromosoomide hübridisatsioon

Sissejuhatus

Üksikute geenide lokaliseerimise määramiseks kromosoomides (st geenide kaardistamiseks) kasutatakse tervet arsenali spetsiaalsed meetodid. Üks peamisi on geeni või selle fragmendi molekulaarne hübridisatsioon (hübriidi moodustamine) kromosoomipreparaatidega, mis on fikseeritud rakkudest eraldatud tahkele alusele. puhtal kujul(seda nimetatakse in situ hübridisatsiooniks). In situ hübridisatsiooni meetodi olemus on interaktsioon (hübridisatsioon) kromosoomide denatureeritud (lahtiharutatud) DNA ahelate ja üheahelalise DNA või RNA kromosoomipreparaadile lisatud komplementaarsete nukleotiidjärjestuste vahel (neid nimetatakse sondideks).

Fluorestsentsmärgisega in situ hübridisatsioon (FISH)

See meetod võimaldas liikuda kromosoomide morfoloogia uurimiselt neid moodustavate DNA järjestuste analüüsimisele FISH-meetodi puhul kasutatakse geenide või kromosoomide intravitaalseks värvimiseks fluorestseeruvaid molekule. Meetodit kasutatakse geenide kaardistamiseks ja kromosoomaberratsioonide tuvastamiseks.

Tehnika algab lühikeste DNA järjestuste, mida nimetatakse sondideks, ettevalmistamisega, mis täiendavad uurimisobjekti esindavaid DNA järjestusi. Sondid hübridiseeruvad (seonduvad) komplementaarsete DNA piirkondadega ja tänu sellele, et need on märgistatud fluorestsentsmärgisega, võimaldavad näha huvipakkuvate geenide paiknemist DNA-s või kromosoomides. Erinevalt teistest kromosoomide uurimise meetoditest, mis nõuavad aktiivset rakkude jagunemist, saab FISH-i läbi viia mittejagunevatel rakkudel, muutes meetodi paindlikuks.

FISH-i saab kasutada erinevatel eesmärkidel kolm sondi erinevat tüüpi:

• lookusespetsiifilised sondid seondumine kromosoomide spetsiifiliste piirkondadega. Neid sonde kasutatakse eraldatud DNA saadaoleva lühikese järjestuse tuvastamiseks, mida kasutatakse märgistatud sondi valmistamiseks ja selle järgnevaks hübridiseerimiseks kromosoomide komplektiga;
• alfaoidsed või tsentromeersed kordussondid on kromosoomide tsentromeersete piirkondade korduvad järjestused. Nende abiga saab iga kromosoomi värvida erineva värviga, mis võimaldab kiiresti määrata kromosoomide arvu ja kõrvalekaldeid nende tavapärasest arvust;
• sondid kogu kromosoomi jaoks on väikeste sondide komplekt, mis täiendavad kromosoomi üksikuid piirkondi, kuid katavad üldiselt kogu selle pikkuse. Selliste sondide raamatukogu kasutades saab "värvida" kogu kromosoomi ja saada indiviidi diferentsiaalse spektraalse kariotüübi. Seda tüüpi analüüsi kasutatakse kromosoomaberratsioonide, näiteks translokatsioonide analüüsimiseks, kui osa ühest kromosoomist kantakse üle teise õlavarre.

Uuringu materjaliks on veri, luuüdi, kasvaja biopsia, platsenta, lootekoed või lootevesi. Kasutada võib nii metafaasi kui ka interfaasi rakupreparaate. Fluorestseeruvate märgistega märgistatud spetsiifilised DNA sondid hübridiseeruvad kromosomaalse DNA-ga ja erinevates lookustes saab kasutada samaaegselt mitut sondi.

FISH on kasulik ja tundlik tsütogeneetilise analüüsi meetod kvantitatiivsete ja kvalitatiivsete kromosomaalsete aberratsioonide, nagu deletsioonid (sh mikrodeletsioonid), translokatsioonid, kahekordistumine ja aneuploidsus, tuvastamiseks. FISH faasidevahelistes kromosoomides toimib kiire meetod 21, 18 või 13 kromosoomi trisoomia sünnieelne diagnoos või sugukromosoomide aberratsioonid. Onkoloogias suudab FISH tuvastada mitmeid hematoloogiliste pahaloomuliste kasvajatega seotud translokatsioone. Meetodit saab kasutada ka vähi jääkmõjude jälgimiseks pärast keemiaravi ja luuüdi siirdamist ning mõne kasvaja halva prognoosiga seotud suurenenud onkogeenide tuvastamiseks. FISH-i kasutatakse ka vastassoost isikult saadud luuüdi allografti ellujäämise jälgimiseks. FISH-i kasutatakse ka spetsiifiliste mRNAde tuvastamiseks ja asukoha määramiseks koeproovis. Viimasel juhul võimaldab FISH-meetod määrata geeniekspressiooni spatiotemporaalsed tunnused rakkudes ja kudedes.

FISH on tundlik meetod kromosomaalsete aberratsioonide tuvastamiseks ja suure (>500) rakkude arvu kiireks analüüsiks korraga. Meetod on väga täpne kromosoomide olemuse ja kromosomaalse DNA tundmatute fragmentide tuvastamisel.

Seega üldine vorm FISH-i seadistamise protokolli saab esitada järgmiselt:

1) Histoloogilise või tsütoloogilise preparaadi valmistamine

Histoloogilise preparaadi valmistamine toimub vastavalt standardskeemile: lõikamine, märgistamine, juhtmestik, valamine, mikrotoomia, lõikekoha asetamine slaidile ja deparafiini eemaldamine. Tsütoloogilise preparaadi valmistamisel kasutatakse spetsiaalseid sadestamislahuseid ja tsentrifuugimist, mis võimaldab saada kontsentreeritud rakususpensiooni.

2) Eeltöötlus (vajadusel)

Preparaati töödeldakse proteaasidega, et kõrvaldada hübridisatsiooni takistavate valkude olemasolu.

3) DNA-sondi rakendamine preparaadile ja sellele järgnev denatureerimine

Sondi ja proovi DNA denatureerimiseks töödeldakse neid formamiidiga ja kuumutatakse temperatuurini umbes 85–90 °C.

4) Hübridiseerimine

Pärast denatureerimist jahutatakse ravim teatud temperatuurini (37ºС). kliinilised uuringud) ja inkubeeritakse niiskes kambris mitu tundi (inkubatsiooni kestus on märgitud igas konkreetses protokollis). Praegu kasutatakse denatureerimiseks ja hübridiseerimiseks automaatseid hübridisaatoreid.

5) Õhetus.

Kui hübridisatsioon on lõppenud, tuleb sidumata sondid ära pesta, mis muidu looks tausta, mis raskendab FISH-i tulemuste hindamist. Loputamiseks kasutatakse tavaliselt tsitraati ja naatriumkloriidi (SSC) sisaldavat lahust.

6) Selja värvimine

Fluorestseeruvate värvainete (DAPI - 4,6-diamidiin-2-fenüülindool; propiidiumjodiid) abil värvitakse kogu tuuma DNA.

7) Tulemuste analüüs fluorestsentsmikroskoobiga

Inimese genoomi uurimisel selle uurimise algfaasis oli eriti oluline meetod nn somaatiliste rakkude hübridisatsioon. Kui inimese somaatilisi (mittesoolisi) rakke segada teiste loomaliikide rakkudega (enamasti kasutati selleks hiirte või hiina hamstrite rakke), võivad teatud ainete juuresolekul nende tuumad ühineda (hübridiseerumine). Selliste hübriidrakkude paljunemisel lähevad mõned kromosoomid kaduma. Katsetajate õnneks kaotavad inimese ja hiire hübriidrakud enamiku inimese kromosoomidest. Järgmiseks valitakse välja hübriidid, milles on alles vaid üks inimese kromosoom. Selliste hübriidide uuringud võimaldasid seostada mõningaid biokeemilisi tunnuseid, rakuline inimesel, teatud inimese kromosoomidega. Järk-järgult õppisid nad selektiivse söötme abil saavutama teatud geene kandvate inimese üksikute kromosoomide säilimise või kadumise.

Rakkude sulandumise hõlbustamiseks erinevad tüübid, lisatakse söötmele UV-inaktiveeritud Sendai viirus või polüetüleenglükool. Inimese ja hiire algsete rakkude konfluentsete rakkude valimiseks kasvatatakse rakke spetsiaalsel selektiivsöötmel, mis võimaldab vohada ainult hübriidrakkudel.

Tänaseks kromogeenne in situ hübridisatsioon on soodsam meetod kui fluorestsents. Kui tegemist on fluorestseeruva in situ hübridisatsiooniga, konjugeeritakse DNA sond fluorestseeruva märgisega. Sellise uuringu tulemusi hinnatakse fluorestsentsmikroskoobi all. Kromogeense in situ hübridisatsiooni korral konjugeeritakse DNA sond peroksidaasiga või millegi muuga ja värvitakse kromogeeniga. Sel juhul hinnatakse tulemusi tavapärase valgusmikroskoobi all.

ü FISH-meetodi eelised

Nagu peamised eelised KALAsid saab eristada järgmiselt:

1) interfaasiliste tuumade geneetilise materjali uurimise võimalus;

2) objektiivsete tulemuste saamine põhimõttel "jah / ei" - see on kvantitatiivne meetod;

3) tulemuste suhteliselt lihtne tõlgendamine;

4) kõrgresolutsiooniga.

ü FISH-meetodi puudused

1) fluorestseeruvad värvained kiiresti "kaovad";

2) tulemuste analüüsimiseks on vaja kvaliteetset fluorestsentsmikroskoopi.

FISH (fluorescence in situ hübridisatsioon) on asendamatu meetod vähi diagnoosimisel. Spetsiifiliste fluorestseeruvate sondide abil võimaldab see meetod tuvastada genoomsete ümberkorralduste olemasolu, st täpsustada diagnoosi, täpsustada prognoosi ja valida vastavalt konkreetsele juhtumile sobiv ravi. Esiteks kasutatakse seda lähenemist onkohematoloogiliste haiguste korral. Varem kasutati nendel eesmärkidel tavapärast karüotüpiseerimist, kuid kui patsiendi rakud ei näita kultuuris märgatavat kasvu, raskendab see selle meetodi abil diagnoosimist tõsiselt. Nendel juhtudel avardab FISH-i kasutamine oluliselt laboridiagnostika võimalusi. Lisaks on FISHi abil lihtsam tõlgendada keerulisi kromosomaalseid ümberkorraldusi.

Laboris kasutatakse sonde tsentromeeride, kromosoomide spetsiifiliste piirkondade ja geenide jaoks. Translokatsioonide otsimiseks valitakse kahevärvilised sondid nii, et kui kahe geeni fragmendid, mis tavaliselt asuvad genoomi erinevates osades, on läheduses, sulanduvad kaks erinevat värvi signaali - üks igast sondist - üheks, mis erineb valgust originaalidest. Nii tuvastatakse näiteks erinevat tüüpi leukeemiate seas levinud BCR-ABL translokatsioonid. Geenid nagu MLL, TEL ja RARα võivad ümber korraldada, moodustades erinevate järjestustega kimäärseid geene. Sel juhul lähenetakse kahele sondile geeni erinevatesse otstesse. Kui geen on terve, on preparaadil igas tuumas üks täpp, kui see on katki, siis kaks erinevat värvi täppi. Tänu sellele on FISH kromosomaalsete translokatsioonide tuvastamiseks paindlikum meetod kui PCR. Sond istub kromosoomil, olenemata sellest, kuidas täpselt teise kromosoomi fragmendi katkemine ja kinnitumine mis tahes konkreetses piirkonnas toimus, erinevalt PCR-is kasutatavatest oligonukleotiididest, mis tunnevad ära spetsiifilised, kuigi tavalised ümberkorraldused.

FISH-i tuvastatud markerite paneel võimaldab hinnata kroonilise lümfoidse leukeemia prognoosi. 11q ja 17p deletsioonid on seotud halva prognoosiga, samas kui 13q deletsioon, nagu tavaline karüotüüp, on seotud soodsa prognoosiga. 12. kromosoomi trisoomiaga võib haigusjuhu omistada keskmisele riskirühmale.

Müeloomi riskikategooria on seotud ka deletsioonide ja translokatsioonide kombinatsiooniga, t(4;14), t(14;16) translokatsioonid ja 17p deletsioon on seotud halva prognoosiga. Sellised diagnostilised uuringud tehakse punase luuüdi biopsiatega pärast rikastamist. Kerge inversioon, millega kaasneb kimäärse EML4-ALK geeni moodustumine, on iseloomulik mitteväikerakk-kopsuvähile. Kimäärse geeni saadus on sihtravi sihtmärk. Sellist ümberkorraldust saab tuvastada ka FISH-meetodil. HER2 amplifikatsiooni hinnatakse sageli kaudse märgiga - ekspressioonitaseme tõus, kasutades selleks immunohistokeemia meetodit, kuid mõnes riigis soovitatakse selleks kasutada FISH-i või vähemalt kasutada seda meetodit kinnituseks.

Fluorestsents in situ hübridisatsioon

Fluorestseeruv hübridisatsioon kohapeal või FISH-meetodit (ingl. Fluorestsents kohapeal hübridisatsioon – KALAD ) - tsütogeneetiline meetod, mida kasutatakse spetsiifilise DNA järjestuse tuvastamiseks ja asukoha määramiseks metafaasi kromosoomides või interfaasilistes tuumades. kohapeal. Lisaks kasutatakse FISH-i spetsiifiliste mRNAde tuvastamiseks koeproovis. Viimasel juhul võimaldab FISH-meetod määrata geeniekspressiooni spatiotemporaalsed tunnused rakkudes ja kudedes.

Sondid

Fluorestseeruva hübridisatsiooniga kohapeal kasutada DNA sonde (DNA sonde), mis seonduvad proovis olevate komplementaarsete sihtmärkidega. DNA sondid sisaldavad fluorofooridega märgistatud nukleosiide (otsene märgistamine) või konjugaate, nagu biotiin või digoksigeniin (kaudne märgistus). Otsese märgistamise korral saab sihtmärgiga seotud DNA sondi jälgida fluorestsentsmikroskoobi abil kohe pärast hübridisatsiooni lõppu. Kaudse märgistamise korral on vajalik täiendav värvimisprotseduur, mille käigus tuvastatakse biotiin fluorestseeruvalt märgistatud avidiini või stepavidiini ning digoksigeniini fluorestseeruvalt märgistatud antikehade abil. Kuigi DNA proovide märgistamise kaudne versioon nõuab täiendavaid reagente ja aega, saavutatakse selle meetodiga tavaliselt kõrgem signaalitase, kuna antikehal või avidiini molekulil on 3-4 fluorokroomi molekuli. Lisaks on kaudse märgistuse korral võimalik signaali kaskaadvõimendus.

DNA proovide loomiseks kasutatakse kloonitud DNA järjestusi, genoomset DNA-d, PCR reaktsiooniprodukte, märgistatud oligonukleotiide ja mikrodissekteerimisel saadud DNA-d.

Sondi märgistamist võib läbi viia erinevatel viisidel, näiteks nick-translatsiooni või märgistatud nukleotiididega PCR abil.

Hübridiseerimise protseduur

Fluorestsentshübridisatsiooni katse skeem kohapeal geeni asukoha lokaliseerimiseks tuumas

Esimene samm on sondide disain. Sondi suurus peaks olema piisavalt suur, et hübridisatsioon toimuks konkreetses kohas, kuid mitte liiga suur (mitte rohkem kui 1 kb), et mitte segada hübridisatsiooniprotsessi. Spetsiifiliste lookuste tuvastamisel või tervete kromosoomide värvimisel on vaja blokeerida DNA sondide hübridisatsioon mitteunikaalsete korduvate DNA järjestustega, lisades hübridisatsioonisegule märgistamata DNA kordusi (näiteks Cot-1 DNA). Kui DNA sond on kaheahelaline DNA, tuleb see enne hübridiseerimist denatureerida.

Järgmises etapis valmistatakse interfaasiliste tuumade või metafaasi kromosoomide preparaadid. Rakud fikseeritakse substraadile, tavaliselt klaasklaasile, millele järgneb DNA denatureerimine. Kromosoomide või tuumade morfoloogia säilitamiseks viiakse denatureerimine läbi formamiidi juuresolekul, mis võimaldab alandada denaturatsiooni temperatuuri 70°-ni.

Seotud DNA sondide visualiseerimine viiakse läbi fluorestsentsmikroskoobi abil. Fluorestsentssignaali intensiivsus sõltub paljudest teguritest – sondi märgistamise efektiivsusest, sondi tüübist ja fluorestsentsvärvi tüübist.

Kirjandus

• Rubtsov N.B. Meetodid imetajate kromosoomidega töötamiseks: Proc. toetus / Novosib. olek un-t. Novosibirsk, 2006. 152 lk.

• Rubtsov N.B. Nukleiinhapete hübridiseerimine kohapeal kromosoomianomaaliate analüüsimisel. Peatükk raamatus "Sissejuhatus molekulaardiagnostikasse" Vol. 2. "Molekulaargeneetilised meetodid pärilike ja onkoloogiliste haiguste diagnoosimisel" / Toim. M.A. Paltseva, D.V. Zaletajev. Õppekirjandus meditsiiniülikoolide üliõpilastele. M.: Meditsiin, 2011. T. 2. S. 100–136.

Märkmed

Wikimedia sihtasutus. 2010 .

Vaadake, mis on "fluorestseeruv in situ hübridisatsioon" teistes sõnaraamatutes:

Sellel terminil on ka teisi tähendusi, vt hübridisatsioon. DNA hübridisatsioon, nukleiinhapete hübridiseerimine in vitro komplementaarsete üheahelaliste nukleiinhapete kombineerimine üheks molekuliks. Täieliku täiendavusega ... ... Wikipedia

In situ hübridiseerimisvõimalusi saab oluliselt suurendada mitme fluorestseeruva värvi samaaegse kasutamisega. Mitmevärvilist fluorestseeruvat in situ hübridisatsiooni (FISH) selle lihtsaimal kujul saab kasutada paljude omaduste märgistamiseks (värvimiseks), kuna hübridiseerimisel kasutatakse erinevaid fluorofoore. Kasutades värvikombinatsioone, mitte üksikuid värve, suudavad digitaalsed pildimikroskoobid samaaegselt tuvastada üksikutes rakkudes palju rohkem värvainega väljendatud omadusi.

Riis. 1. Mitmevärviline KALA

Üksikasjalikuks tutvumiseks maailma suuremate optiliste süsteemide ja nendega seotud seadmete tootjate fluorestsentsmikroskoopidega külastage meie kataloogi või võtke ühendust meie spetsialistidega ja saage kõigis küsimustes täielikku professionaalset konsultatsiooni.

Joonisel 1 on kujutatud tüüpiline mitmevärviline fluorestsentshübridisatsioon – FISH muster. Normaalsed isased lümfotsüüdid hübridiseeriti FITC-biotiiniga, mis oli värvitud Chr2l ja ChrY sondidega, ja CY3-digoksigeniiniga, mis värviti Chrl3 ja ChrY sondidega. Üleval vasakul – DAPI-ga värvitud DNA tuumad, mis on saadud DAPI filtriga. Paremal üleval on FITC-värvitud kujutis Chr2l-st ja ChrY-st, mis on saadud FITC-filtriga. All vasakul - Chrl3 ja ChrY värvitud CY3-ga, saadud kasutades CY3 filtrit. Alumine parempoolne pilt on liitpilt, mis näitab kõiki sihtkromosoome värviliselt. Selle proovi andis dr Tim Housel, Integrated Genetics, Framingham, Massachusetts.

Mitmevärviline FISH-tehnika koos digitaalse pildistamise tehnikatega pakub nüüd enneolematut mitteisotoopset mitme nukleiinhappejärjestuse tuvastamist rakukomponentide, kromosoomide ja geenide analüüsimiseks.

Fluorestsentsi – nähtust, mille puhul keemiline ühend ergastub ühel valguse lainepikkusel ja kiirgab teisel, tavaliselt pikemal lainepikkusel – kasutatakse kõikides bioloogiateadustes mitmesuguste struktuuride ja rakusiseste protsesside uurimiseks. Värvainete ja mikroskoopide väljatöötamise tehnoloogia areng on viimase kümnendi jooksul viinud fluorestsentsmeetodite kiire arenguni.

See ülevaateartikkel kirjeldab FISH-meetodi põhialuseid, piiranguid, millega teadlased FISH-i aastate jooksul kokku puutusid, hiljutisi arenguid riistvara, tarkvara, värvainete ja reaktiivide vallas, mis on selle meetodi väljatöötamist mõjutanud, ning praeguseid suundumusi selles valdkonnas. Käesolevas artiklis käsitletakse ka selle meetodi viimaseid saavutusi, mis viisid selle kasutamiseni mitte ainult uurimislaborites, vaid ka kliinilises diagnostikas.

FISH-meetodi ülevaade

FISH-i rakendamine kasvab kiiresti genoomikas, tsütogeneetikas, sünnieelsetes uuringutes, neoplasmi bioloogias, radioaktiivsetes märgistustes, geenide kaardistamises, geenide amplifikatsioonis ja biomeditsiinilistes alusuuringutes. Põhimõtteliselt on see meetod üsna lihtne.

Hübridiseerimine identifitseerib või märgistab sihtmärgiks olevaid genoomseid järjestusi, et oleks võimalik jälgida nende asukohta ja suurust. Sobivate kromosoomide DNA või RNA järjestused märgistatakse esmalt reporterrühmadega, mis hiljem identifitseeritakse fluorestsentsmikroskoopia abil. Märgistatud DNA või RNA sond hübridiseeritakse seejärel klaasklaasil metafaasi kromosoomide või puhketuumadega. Pärast signaali pesemist ja võimendamist uuritakse proovi reporterrühmade suhtes, kasutades fluorestsentsmikroskoopiat.

FISH võimaldab saavutada morfoloogiliste ja genoomsete struktuuride väga kõrge ruumilise eraldusvõime. See meetod on üsna kiire, hõlpsasti rakendatav ja seda iseloomustab kõrge värvaine stabiilsus. Olenevalt kasutatavast sondist on võimalik määrata indiviidi genoom, terved kromosoomid, kromosoomide lõigud ja unikaalsete koopiate järjestused.

Varasemad piirangud

Kuni viimase ajani on FISH-i piiranud riistvara, tarkvara, reaktiivid, värvitehnoloogia ja suured teostuskulud. Kaubanduslikult saadav mikroskoobi riistvara, mis on optimeeritud mitmevärvilise FISH-i jaoks, oli saadaval alles 1990. aastate keskpaigas. Enne seda tuli mikroskoobid FISH-rakenduste jaoks spetsiaalselt konfigureerida. Enamik mikroskoopilisi optikaid ei olnud ette nähtud FISH-ile iseloomulike madala taseme valgussignaalide tuvastamiseks. Kuna selle meetodi abil paranes oluliselt genoomide lahutusvõime, suurenesid ka nõuded mikroskoopilisele optikale. Probleemiks olid ka kromaatilised aberratsioonid paljudel lainepikkustel. Eelkõige mitmevärvilise analüüsi jaoks tuli kõik läätsed, sealhulgas koonduv lääts, kromaatiliste aberratsioonide suhtes korrigeerida. Lisaks oli väga raske reguleerida epifluorestsentstulesid ühtlase valgustuse saamiseks.

Mitmevärviliste FISH-piltide analüüs nõuab erinevate signaalide eraldamist kas (a) eraldi filtrikuubikutega või (b) lairiba dikroiliste ja lävifiltritega ergastusfiltri massiivi abil. Filtritehnoloogia areng on parandanud mõningaid varasemaid probleeme, mis on põhjustatud optilisest nihkest ja üksikute filtrikuubikute vahelisest mehaanilisest ümberlülitamisest põhjustatud nihkest. Asendatavad ergastusfiltrid, mida kasutatakse koos mitmeribaliste dikrootiliste ja lävifiltritega, võivad tõhusalt töötada kolme värviga, kasutades iga värvi jaoks eraldi ergastusfiltreid ilma nihet tuvastamata. Kuid rohkem kui kolme värviga töötades peate siiski kasutama üheribalisi filtreid.

Andmete kogumiseks kasutati kiiret värvifilmi ehk CCD (Charge-Coupled Device) ja mõlemal juhul esines probleeme värvide täpsusega. Lisaks esines probleeme kattuvate erinevate värvidega piltidega, mis võeti samast proovist, kasutades erinevaid värvisonde.

Fluorestseeruvate reagentidega valmistatud proovide kvantitatiivse analüüsi tarkvara jättis samuti soovida, kuna olemasolevad pildianalüüsisüsteemid ei olnud optimeeritud fluorestseeruvate prooviproovidega töötamiseks. Visuaalne analüüs on aeganõudev ja sageli subjektiivne protseduur, nii et ilma täiustatud fluorestsentskujutist kasutamata oli fluorestsentsproovide analüüs keeruline ja mitmetähenduslik. Tavaliselt pidid teadlastel olema oma programmeerijad, et töötada välja oma programmid pildianalüüsi jaoks.

Ainult reaktiividest ja värvainetest ei piisanud kõigi rakenduste jaoks. Näiteks hübridisatsiooni asukoha määramise efektiivsus vähenes sondi suuruse vähenemisega, mis piiras tõsiselt fluorestsentsmikroskoopia abil jälgitavaid proove. Erinevate fluorestseeruvate värvainete arv oli piiratud; lisaks oli neil madal fotostabiilsus. Kuid fluorestsentsvärvitehnoloogia ja sellega seotud tehnoloogiate arendamine föderaalselt rahastatava inimgenoomi projekti raames kannab nüüd vilja. Kõigi inimese kromosoomide sondid on juba olemas ja ka saadaolevate geenisondide arv kasvab. In situ hübridisatsioonikomplektid ja fluorestsentsmärgistusega sondid on nüüd kaubanduslikult saadaval mitmelt ettevõttelt.

Hind oli veel üks suur takistus. Kuna turul ei olnud müügilolevaid FISH-süsteeme, pidid teadlased koostama eritellimusel valmistatud süsteeme, sealhulgas reaktiive, sonde, mikroskoopi, pildistamist, andmeanalüüsi ning aruandlusriist- ja tarkvara. Mitmevärvilise FISHi läbiviimine keeruka pildianalüüsiga võib uurijale maksta üle 200 000 dollari – summa, milleni on enamikul kliinilistest uurijatest raske jõuda. Seetõttu pole paljud teadlased, kes soovivad FISHi oma laborites kasutada, suutnud seda teha.

KALA on muutunud laialdaselt kättesaadavaks

Paljud riist- ja tarkvaratootjad on kohandatud süsteemide alternatiivina välja töötanud taskukohased valmissüsteemid. Paljude FISHiga seotud ettevõtete ja laborite vahel välja kujunenud koostööõhkkond on toonud kaasa selles valdkonnas uusi läbimurdeid. Ja avaldatud teoste autorid arvestavad oma saavutustega just sellise koostöö raames.

Riis. 2. MultiFluor tööekraan

USA-s töötav süsteem, mis pakub kaubanduslikult saadaolevatele FISH-i uurimissüsteemidele keskmisi hindu, integreerib paljude tootjate komponente ning tugineb pilditöötlustarkvara, mikroskoobi riistvara ja muude tarvikute uusimatele edusammudele. Kliiniliste uuringute laborite jaoks osutub see süsteem kasulikuks paljudes rakendustes. Olles integreeritud ja automatiseeritud, võimaldab see kliinilisi uuringuid täielikult läbi viia.

Siin esitatud tarkvarasüsteem on MultiFluor™, mitme parameetriga pildisüsteem (Biology Research Systems), mis on välja töötatud Microsoft® Windowsis (Microsoft Corporation, Bellevue, Washington) mitmevärviliste FISH-proovide struktuuri- ja molekulaaromaduste tuvastamiseks, analüüsimiseks ja esitamiseks. . Analüüsi aega ja tulemuste täpsust parandab iga proovi paljude tunnuste korreleerimine erinevatel lainepikkustel. See süsteem hõlbustab piltide hankimist, salvestamist, andmebaaside haldamist, automaatset mikroskoobi juhtimist ja täielikku graafilist andmete analüüsi.

Joonis 2 näitab MultiFluori andmete ülevaatekuva. Kasutajad saavad vaadata pilte ja nendega seotud andmeid ning võrrelda erinevates värvides (erinevatel lainepikkustel) kogutud mitme parameetriga andmeid, kasutades erinevaid graafikutööriistu, sealhulgas histogramme, hajuvusgraafikuid jne. Siin kuvatakse erinevad graafikud koos mitmete graafikute komplektiga. värvirakkude kujutised (mis kujutavad DAPI tuumasid, FITC-ChrX, CY3-ChrY ja CY5-Chr2l) koos tabelis esitatud lähteandmetega.

FISH-i teadlastel on võimalus automaatselt hankida pilte erinevatel lainepikkustel erinevatel fookustasanditel, visualiseerida mitmevärvilisi FISH-sonde, teha märkusi ja printida pilte, salvestada ja hankida suures koguses mitmevärviliste kujutiste andmekogumeid. Mitmevärvilisi FISH-i metafaasi kromosoome saab analüüsida geenikaardistamise, võrdleva genoomse hübridisatsiooni (CGH) ja karüotüübi genereerimisega. Kasutaja valitud proovi piirkondi saab skaneerida ja analüüsida. Tarkvara teravustab süsteemi automaatselt, hangib kujutisi mitmel lainepikkusel, jätab meelde rakkude asukoha klaasklaasil ja mõõdab erinevaid omadusi, sealhulgas sondi loendust, fluorestsentsi intensiivsust ja raku morfomeetriat. Erinevad omadused erinevatel lainepikkustel võivad olla omavahel korrelatsioonis.

Süsteemi täiendav omadus on võimalus töötada võrku ühendatud personaalarvutitega (PC). Tüüpilises konfiguratsioonis on üks arvuti võrgujaam, mis on ühendatud kaamera ja mikroskoobi riistvaraga. See arvuti juhib piltide saamist ja teostab kohest analüüsi. Teised personaalarvutid on infoanalüüsi sekundaarjaamad, kus töödeldakse esimesest arvutist saadud andmeid või kus tehakse autonoomselt mõni spetsiaalne analüüs.

Programm võimaldab teil esitada kõik komponendid eredates pseudovärvides samaaegseks mitmevärviliseks visualiseerimiseks. Näiteks saab neljavärvilise katse üheaegseid pilte (kasutades DAPI (sinine), FITC (roheline), CY3 (punane) ja FITC-CY3 (kollane) kombinatsiooni) esitada eraldi või kombineerida üheks pildiks (nagu näidatud joonisel 1) . Iga pilti saab huvipakkuvate funktsioonide esiletõstmiseks interaktiivselt täiustada. Programmi kasutades on lihtne koostada histogramme, hajuvusdiagramme, tabeleid, joongraafikuid ja muid andmete esitamise ja hindamise vorme (joonis 2). Lisaks salvestatakse andmeid kergesti ligipääsetavates ja populaarsetes vormingutes nagu TIFF, JPEG, GIF ja teised.

Onkoloogilised, sünnieelsed ja bioloogilised uuringud

FISH-i kirjeldatud süsteemid on loodud uurijatele paremini juurdepääsetavateks kui varasemad eritellimusel valmistatud süsteemid. Neid kasutatakse üha enam onkoloogias, patoloogias, tsütogeneetikas ja arengubioloogias. Nende rakenduste hulgas on faasidevaheliste rakkude analüüs mitmevärviliste värvainetega täheldatud laikude arvu, immunofenotüpiseerimise, raku morfomeetria ja DNA koostise järgi.

Need süsteemid analüüsivad kromosoomide koopiate arvu kõrvalekaldeid, mis on korrelatsioonis DNA kogu koostisega, mis on seotud kasvajate moodustumisega. Põis. Sünnieelsetes uuringutes saab neid süsteeme kasutada aneuploidsuse tuvastamiseks puhketuumades, mis on seotud sünnieelsete defektidega, sealhulgas Downi sündroomi, Turneri sündroomi, Klinefelteri sündroomi ja teistega. Raku- ja arengubioloogias saab seda süsteemi kasutada rakupinna markerite ja nende suhtelise jaotuse (nt retseptorid, tsütoplasmaatilised markerid, sealhulgas tsütoskeleti valgud, messenger-RNA-d ja spetsiifilised geenid) kaardistamiseks.

Diagnostiline potentsiaal

Viimase pooleteise aastakümne jooksul on selgunud, et FISH-meetodil on tohutu potentsiaal mitte ainult uurimistöö vahendina, vaid ka kliinilises diagnostikas sellistes valdkondades nagu sünnieelne diagnostika, tsütogeneetika ja kasvajate areng. Kvaliteetsete taskukohaste süsteemide puudumine mitte ainult ei takistanud FISH-i levikut teadlaste seas, vaid muutis selle meetodi kättesaamatuks paljude meditsiiniasutuste diagnostikakeskuste jaoks.

Selle süsteemiga on nüüd võimalik saavutada tulemusi, mida varem oli võimalik saada ainult kallite, eritellimusel valmistatud seadmetega – ja see on selle üks olulisemaid eeliseid. Unistus rakendada FISH-i mitte ainult laiemalt biomeditsiinilistes uuringutes, vaid panna see otse patsientide teenistusse, võib lähitulevikus reaalsuseks saada.

Fluorestsentsstereomikroskoopia

Epifluorestsentsvalgustus

Kuni viimase ajani oli fluorestsentsvalgustus saadaval ainult spetsiaalsete suure avaga objektiividega varustatud uurimismikroskoobidel. Selle tehnika stereomikroskoopia vajadus on suurenenud geneetiliselt kodeeritud ja bioloogiliselt spetsiifiliste fluorestseeruvate valkude, nagu GFP (roheline fluorestsentsvalk) tulekuga.

Riis. 1. Stereomikroskoop epifluorestsentsvalgustiga

Stereomikroskoopide kasutamine GFP vaatlemiseks on nii laialt levinud, et stereofluorestsentsvalgusteid nimetatakse sagedamini GFP illuminaatoriteks, hoolimata sellest, et neid saab kasutada paljudes muudes rakendustes nii bioteadustes kui ka elektroonikatööstuses. Suuri isendeid, nagu vastsed, nematoodid, sebrakala, munarakud ja küpsed putukad, on GFP-ga värvimisel ja fluorestsentsvalgusega valgustamisel lihtne jälgida (ja neid on lihtne manipuleerida). Fluorestseeruv valgustus näitab, millised organismid toodavad fluorestseeruvat valku, ning stereoskoopiline vaatlus koos suure vaatevälja ja pika töökaugusega võimaldab vaatlejal katse ajal kasutada pintsette, pipette või mikromanipulaatoreid. Ka teisi tüüpilisemaid proove on lihtne uurida fluorestsentsvalgustusega stereomikroskoopide abil.

Stereomikroskoobi epifluorestsentsvalgusti toimib sarnaselt keerukamate mikroskoopide omadele. Tavaliselt on fluorestsentsvalgusti ksenoon- või elavhõbedakaarlamp, mis on paigutatud välise valgustusseadme komplekti, mis on mikroskoobiga ühendatud vahetoru (või vertikaalse valgusti, vt joonised 1 ja 2) kaudu, mis asub mikroskoobi suumi ja okulaari torude vahel. Praeguseks on seda tüüpi valgustus piiratud tavaliste läätsede (CMO) stereomikroskoobirakendustega, kuna kaubanduslikult saadavaid osi ei saa kasutada Grenoux stereomikroskoobi või muu konvergentse stereomikroskoobi reguleerimiseks fluorestsentsvalguse jaoks.

Kaarlambi kiiratav valgus suunatakse läbi reguleeritava koonduva kollektorläätse kombineeritud filtriplokis asuvasse ergastusfiltrisse (nagu on näidatud joonistel 2 ja 3). See filter edastab valgust ainult teatud lainevahemikus (ribalaius). Seejärel suunatakse filtrit läbinud valgus mööda mikroskoobi optilist rada selle alumisse ossa (stereomikroskoobis suumimoodul ja objektiiv) ja suunatakse näidisse dikroilise peegli abil, mis olenevalt seadistusest peegeldab. , filtreerib ja/või edastab valikuliselt teatud pikkusega spektri laineid/piirkondi. Mõiste dikroonne (või dikromaatiline) viitab filtri või peegli omadusele "eristada" langeva valguse värve, peegeldades valgust, mille värvus langeb allapoole antud lainepikkuse piiri, ja edastades värve sellest piirist kõrgemal.

Riis. 2. Kiirte tee fluorestseeruvas stereomikroskoobis

Ergastusvalguse fokusseeritud kiir läbib suumi ja läätse, kus see moodustab ümberpööratud valguskoonuse, mis kiiritab proovi, põhjustades kõigi proovis olevate fluorofooride ergastumist, mille neeldumisriba vastab kiiritava valguse läbilaskvusribale. Proovist eralduv sekundaarne fluorestsentsvalgus (tavaliselt pikem kui ergastuslainepikkus) püütakse kinni stereomikroskoobi ühise põhieesmärgiga ja suunatakse läbi suumi tagasi lävifiltrisse, mis blokeerib valguse ergastuslainepikkusel ja lubab ainult valgust emissioonil. läbitav lainepikkus. Joonistel 1 ja 2 kujutatud mikroskoobi toru on konstrueeritud nii, et fluorestsentskiirguse pikemad lainepikkused, mis läbivad suumi vasakut ja paremat optilist kanalit, fokusseeritakse sõltumatult enne, kui need jõuavad epifluorestsentsvalgustini. Vasakust kanalist tulev valgus läheb otse lävifiltrisse, misjärel see suunatakse okulaari torudesse või fotoporti. Seevastu parempoolses kanali valgus suunatakse esmalt tagasi läbi dikroonse peegli ja seejärel lävifiltri ja okulaaridesse. Sellel valgustil puudub väljund kaameraporti ja seda saab kasutada ainult näidisvaatluseks.

Fluorestseeruva kombineeritud filtripanga konstruktsiooni üksikasjad on näidatud joonistel 2 ja 3. Iga plokk sisaldab ühte riba ergastusvalguse filtrit, kahte lävifiltrit ja dikrootilist peeglit. Elavhõbeda kaarlambi valgus siseneb filtriplokki läbi ergastusfiltri ja peegeldub kahevärvilise peegli pinnalt, nagu eespool kirjeldatud ja nagu on näidatud joonisel 3. Sekundaarne fluorestsentskiirgus läbib lävifiltreid. Süsteemi on liimitud vasaku kanali ergutusfilter, dikrooppeegel ja lävefilter ning parema kanali lävefilter on kinnitatud väikesesse raami, mille saab ploki küljest eemaldada selle kinnituskruvisid lahti keerates. Kui eemaldate lävifiltri, pääsete ligi filtriüksuse sees asuvale kahevärvilisele peeglile. Asendusfiltrite paigaldamisel olge ettevaatlik, et filtrite pinnale ei satuks liimi, ning kandke enne filtrite ja kahevärvilise peegli käsitsemist kindaid, et vältida sõrmejälgede pinnale sattumist.

Fluorestseeruv vertikaalne valgusti mahutab tavalise ereda väljavaatluse jaoks kolm filtripanka ja tühja dia-filtripanka (filtreid pole). Filtriüksused on paigaldatud siinidele ja asetatakse optilisele teele, kasutades siinide asendit reguleerivat käepidet. Iga seadmega on kaasas sobiv identifitseerimissilt. Sildid sisestatakse järjestikuses järjekorras illuminaatori korpuses olevasse pilusse, nii et kasutaja saab hõlpsasti valida fluorestsentsvaatluse jaoks õige filtri.

Riis. 3. Fluorestsentsfiltrite kombinatsioonid stereomikroskoobis

Filtrikombinatsioonide komplekt on näidatud tabelis 1. Need filtrid katavad laias valikus fluorestseeruvat ergastust ja emissiooni ning peaksid olema kasulikud paljudes bioloogilistes uuringutes, kus kasutatakse tavalisi fluorestseeruvaid värvaineid. Need filtrikombinatsioonid sobivad ka tööstuslikeks rakendusteks, näiteks IC-plaatide analüüsimiseks fotoresistide fluorestseeruva polümeeri saastumise tuvastamiseks. Valides sobiva ergastus-/emissioonifiltrite kombinatsiooni, saab kasutada fluorestseeruvaid sonde, mille ergastuslainepikkused jäävad vahemikku 380–510 nanomeetrit (vt tabel 1). Need filtrikombinatsioonid on väga kasulikud ka uuringutes erinevate roheliste fluorestseeruvate valgu mutantidega, sealhulgas nende tsüaani ja sinisega.

Fluorestseeruvalt märgistatud valkudega elusrakukultuurides saab signaali intensiivsust oluliselt suurendada, kui filtrikombinatsioonid vastavad täpselt fluorofooride ergastus- ja emissiooniprofiilile. Näiteks DS-punaste signaalide puhul saab punase fluorestsentsi visuaalset vaatlust ja pildistamist fotodetektorite abil oluliselt parandada, nihutades punast signaali rohkem oranži valguse kiirgamise suunas. Lisaks on intensiivse klorofülli taustaga autofluorestsentsiga taimeproovidele kohandatud filtrikombinatsioonid sageli tõhusamad, kui need on õigesti sobitatud vastavate filtri- ja emissioonisignaali spetsifikatsioonidega. Mikroskoobi projekteerimisinsenerid võtavad paljusid neist kriteeriumidest arvesse, et optimeerida erinevate stereomribalaiust.

Tab. 1. Stereomikroskoopide fluorestsentsfiltrite kombinatsioonid

Filtrikomplekt	Ergastuse lainepikkuste vahemik	dikroiline peegel	Emissiooni lainepikkuste vahemik
Sinine GFP/DAPI
Sinine (EGFP) GFP
GFP ribalaius
Laiendatud GFP ribalaius
TRITC (Ds-punane)
Kollane GFP ribalaius

Nagu kõik tundlikud interferentsifiltrid, ebaõnnestuvad ka kombineeritud filtrid intensiivse valguse ja ultraviolettkiirguse tõttu. Sellised omadused nagu ribalaius ja läbilaskvus muutuvad ka siis, kui filtreid kasutatakse ja hoitakse niiskes keskkonnas. Pikema eluea tagamiseks tuleks neid filtreid hoida ahjus või kuivatusainega suletud anumas. Kui te ei jälgi, tuleks illuminaatori katik hoida suletuna, et vähendada filtreid läbiva valguse hulka. Filtrit saab puhastada ainult kuiva õhuga kanistrist, pehme kaamelikarva harjaga või õlivaba gaasiga gaasipudelist. Kriimustuste ja hõõrdumise vältimiseks ärge kunagi pühkige pehme interferentskattega filtritega filtreid objektiivi puhastuslapiga.

Kaarlampide teravustamine ja joondamine

Selle Mercury või Xenon Burneri interaktiivse õpetuse abil saate praktilisi kogemusi kaarlampide joondamisel ja teravustamisel, mis simuleerib kogu lampide joondamise protsessi fluorestsentsmikroskoobis.

Stereomikroskoopide abil saab fluorestsentsvalguses jälgida erinevaid proove. Objektiivi 0,5-1,6-kordse suurenduse ja kuni 15-kordse suumivahemikuga suudavad need stereomikroskoobid pakkuda süsteemi kogusuurendust 4x kuni 540x, mis on võrreldav klassikaliste liitmikroskoopide vaateulatusega. Lai suurendusvahemik võimaldab mikroskoobidel vaadelda nii suuri elavaid isendeid kui ka peeneid detaile slaidile asetatud fluorokroomidega värvitud õhukestes osades. Suure suurendusega fluorestsentsvaatluse näide on näidatud joonisel 4. See näitab kolme märgiga määrdunud paksu hiire neeru. Proov värviti DAPI, Alexa Fluor 488 WGA ja Alexa Fluor 568 abil (kasutades Alexa Fluor sonde ja Molecular Probes'i proovi ning vaadeldi kolme filtrikombinatsiooniga tabelist 1: sinine GFP/DAPI, Endow GFP Bandpass, TRITC DsRed. See pilt selgelt demonstreerib keeruliste mikroskoopide jaoks ettevalmistatud proovide vaatlemisel suure suurendusega fluorestseeruva stereomikroskoopia võimalusi.

Riis. 4. Lõige hiire neerust fluorestsentsvalguses

Teised stereomikroskoopide tootjad pakuvad fluorestseeruva ergastuse ja vaatluse jaoks alternatiivseid valgustusmeetodeid. Kõige populaarsem konfiguratsioon, mis on näidatud joonisel 5, kasutab fluorestsentsergastamiseks välist vooluringi, mis ei kasuta kujutismikroskoobi optilist süsteemi. Illuminaatorist tulev valgus läbib kõigepealt ergastusfiltri ja seejärel mikroskoobi korpuse tagaosas asuva toru. Toru põhjas on läätsesüsteem, mis suunab ergastava valguse proovile. Selles konfiguratsioonis suunatakse valgus otse proovile mis tahes suurendusega, tagades sellega sama fluorestseeruva valgustuse intensiivsuse ja ühtlase tumeda tausta mis tahes suurendusega.

Värvitud proovi sekundaarne fluorestsentsvalgus püütakse kinni ühise esmase objektiiviga (joonis 5) ja suunatakse läbi suumiploki kanalite mikroskoobi ülaosas asuvatesse lävifiltritesse. Seejärel suunatakse valgus kas otsevaatluseks okulaaride poole või digitaalseks pildistamiseks või fotomikrograafiaks kaamera torusse. See konfiguratsioon ei vaja dikrootilisi peegleid ja see on selle peamine eelis, teine ​​eelis on sõltumatus eelmonteeritud filtripankadest, mis annab uurijale suurema vabaduse filtrite valikul. Kuid see konfiguratsioon võib kogenematute operaatorite jaoks vale filtrikombinatsiooni tõttu põhjustada vigu.

Riis. 5. Eraldi ergastavate valguskiirte teekonnaga mikroskoop

Fluorestsentsmikroskoopias ergastava valgusallikana kasutatava elavhõbeda kaarlambi intensiivne ultraviolettkiirgus võib põhjustada võrkkesta tõsist kahjustust. Selle vältimiseks on paljudel mikroskoopide tootjatel korpusel kaitseseadmed, mis filtreerivad välja ultraviolettvalgust, mis proovi laval kiiritab. Muud ettevaatusabinõud hõlmavad ultraviolettkiirguse väljalülitusfiltreid vaateteel ja hajuva valguse kaitset valgustusseadme ümber. Fluorestseerivate interferentsifiltri juhikute ja pöörderaamide sisse on sageli sisestatud filtrikujulised pistikud, kui neid ei kasutata.

Fluorestseeruvad stereomikroskoobid on sageli varustatud spetsiaalse diafragmaga, mis asub kusagil elavhõbedavalgusti ja vertikaalse valgusti vahel, et blokeerida lambist lähtuv ohtlik ultraviolettkiirgus, kui näidist ei jälgita. Kui vaatlusi ei tehta, tuleb see diafragma asetada valguse teele.

Kui proove vaadeldakse kiirete apokromaatiliste objektiividega (1,6x kuni 2,0x), võivad vaatevälja alumises osas tekkida peegeldused või kuumad kohad. See artefakt ilmub tavaliselt ainult madala suumisuhte korral ja kaob suure suurenduse korral. Enamasti peegeldusi ei teki, kui objektiivi suurendus on väike (vahemikus 0,5x kuni 1,0x), olenemata optilisest korrektsioonist ning suure arvulise ava ja madala korrektsiooniobjektiivide (akromaadid või plaaniakromaadid) korral see efekt tavaliselt puudub.

Nagu on näidatud tabelis 2, on fluorestsentsmikroskoopias palju rakendusi, kus kasutatakse stereomikroskoope. Selles režiimis mugavalt vaadeldavate proovide arv on väga suur ja need kuuluvad väga erinevatesse distsipliinidesse alates bioloogiast kuni tööstusliku tootmiseni.

Tab. 2. Fluorestseeruva stereomikroskoopia rakendused

Piirkond	Rakendused – analüüs
Bioloogia	Geeniekspressioon, rakkude sorteerimine, dissektsioon, arenguprotsessid, silma- ja lihasuuringud
Botaanika
Farmakoloogia	Kapillaaride vool, ravimid, keskkonnavaatlused
Hüdroloogia	Vee kvaliteet, rakustruktuurid ja filtrimembraanide analüüs
Agronoomia	Seemneuuringud, geeniekspressioon ja transgeneetika
Elektroonika	Jootepasta, epoksüanalüüs, pinnakatte testimine, polümeeride valik integraallülitustele
Pooljuhid	Fotoresisti saastumine, võõrosakesed, tootmiskontroll
Polümeerid	Võõrosakeste, tühimike, graanulite, polümeriseerumata alade olemasolu
metallitöötlemine	Praod, pinnadefektid, saastumine, keevitamine, murdude analüüs
materjalid	Praod, keevitamine, süsinikuühendused, orientatsiooniuuringud
paberi tootmine	Kiud, katted ja kandmised
Kohtuarstlik ekspertiis	Tekstiilkiud, kehavedelikud, sõrmejäljed, pangatähed, võltsingud

Fluorestseeruval stereomikroskoopial on klassikalise liitmikroskoobiga võrreldes ainulaadne kolmemõõtmelise vaatluse omadus. Lisaks pakuvad stereomikroskoobid suuremat töökaugust ja teravussügavust, mille tulemuseks on laiem panoraamvaateväli ja intensiivsem fluorestsents. Need omadused on väga olulised teadlastele, kes peavad töötama suurte bioloogiliste proovide ja materjalidega, ning spetsialistidele, kes tegelevad ettevalmistustöödega, nagu komponentide kokkupanek, elektroonika tootmise kontroll või lõikamine. Kuna erirakenduste jaoks muutuvad kättesaadavaks üha täpsemad filtrikombinatsioonid, kasvab fluorestsentsi kasutamine stereomikroskoopias jätkuvalt.