Լյումինեսցենտային հիբրիդացում in situ. Նուկլեինաթթուների in situ հիբրիդացում Մեթոդը հիմնված է ֆլուորեսցենտային in situ հիբրիդացման կիրառման վրա՝ FISH տեխնոլոգիա

Դասախոսություն 4

Քրոմոսոմների հիբրիդացում

Ներածություն

Քրոմոսոմների վրա առանձին գեների տեղայնացումը որոշելու համար (այսինքն՝ գեների քարտեզագրում), օգտագործվում է մի ամբողջ զինանոց. հատուկ մեթոդներ. Հիմնականներից մեկը գենի կամ դրա հատվածի մոլեկուլային հիբրիդացումն է (հիբրիդի ձևավորումը) բջիջներից մեկուսացված պինդ հենարանի վրա ամրացված քրոմոսոմային պատրաստուկներով։ մաքուր ձև(սա կոչվում է in situ հիբրիդացում): In situ հիբրիդացման մեթոդի էությունը փոխազդեցությունն է (հիբրիդացումը) քրոմոսոմներում դենատուրացված (չքանդված) ԴՆԹ-ի շղթաների և միաշղթա ԴՆԹ-ի կամ ՌՆԹ-ի քրոմոսոմային պատրաստմանը ավելացված լրացուցիչ նուկլեոտիդային հաջորդականությունների միջև (դրանք կոչվում են զոնդեր):

Լյումինեսցենտային պիտակավորված in situ հիբրիդացում (FISH)

Այս մեթոդը հնարավորություն տվեց քրոմոսոմների մորֆոլոգիայի ուսումնասիրությունից անցնել դրանք կազմող ԴՆԹ-ի հաջորդականությունների վերլուծությանը:FISH մեթոդը օգտագործում է լյումինեսցենտային մոլեկուլներ գեների կամ քրոմոսոմների ինտրավիտալ ներկման համար: Մեթոդն օգտագործվում է գեների քարտեզագրման և քրոմոսոմային շեղումների նույնականացման համար:

Տեխնիկան սկսվում է ԴՆԹ-ի կարճ հաջորդականությունների պատրաստմամբ, որոնք կոչվում են զոնդեր, որոնք լրացնում են ԴՆԹ-ի հաջորդականությունները, որոնք ներկայացնում են ուսումնասիրության առարկան: Զոնդերը հիբրիդացվում են (կապում) ԴՆԹ-ի կոմպլեմենտար շրջաններին և, քանի որ դրանք պիտակավորված են լյումինեսցենտային պիտակով, թույլ են տալիս տեսնել ԴՆԹ-ում կամ քրոմոսոմներում հետաքրքրող գեների տեղայնացումը: Ի տարբերություն քրոմոսոմների ուսումնասիրման այլ մեթոդների, որոնք պահանջում են ակտիվ բջիջների բաժանում, FISH-ը կարող է իրականացվել չբաժանվող բջիջների վրա՝ դարձնելով մեթոդը ճկուն:

FISH-ը կարող է կիրառվել տարբեր նպատակներով՝ օգտագործելով երեք զոնդ տարբեր տեսակներ:

• լոկուս-հատուկ զոնդերկապվում է քրոմոսոմների որոշակի շրջանների հետ: Այս զոնդերն օգտագործվում են մեկուսացված ԴՆԹ-ի հասանելի կարճ հաջորդականությունը նույնականացնելու համար, որն օգտագործվում է պիտակավորված զոնդ պատրաստելու և դրա հետագա հիբրիդացման համար քրոմոսոմների մի շարքով.
• ալֆաոիդ կամ ցենտրոմերային կրկնվող զոնդերքրոմոսոմների ցենտրոմերային շրջանների կրկնվող հաջորդականություններ են։ Նրանց օգնությամբ յուրաքանչյուր քրոմոսոմ կարելի է ներկել այլ գույնով, ինչը թույլ է տալիս արագ որոշել քրոմոսոմների քանակը և դրանց նորմալ թվից շեղումները.
• զոնդեր ամբողջ քրոմոսոմի համարփոքր զոնդերի մի շարք են, որոնք լրացնում են քրոմոսոմի առանձին շրջանները, բայց ընդհանուր առմամբ ընդգրկում են դրա ամբողջ երկարությունը: Օգտագործելով նման զոնդերի գրադարանը՝ կարելի է «գունավորել» ամբողջ քրոմոսոմը և ստանալ անհատի դիֆերենցիալ սպեկտրային կարիոտիպ։ Անալիզի այս տեսակն օգտագործվում է քրոմոսոմային շեղումները վերլուծելու համար, ինչպիսիք են տրանսլոկացիաները, երբ մի քրոմոսոմի մի կտոր տեղափոխվում է մյուսի թևը:

Ուսումնասիրության նյութը արյունն է, ոսկրածուծը, ուռուցքի բիոպսիան, պլասենտան, պտղի հյուսվածքները կամ ամնիոտիկ հեղուկը: Կարող են օգտագործվել ինչպես մետաֆազային, այնպես էլ միջֆազային բջիջների պատրաստուկներ: Լյումինեսցենտային պիտակներով պիտակավորված ԴՆԹ-ի հատուկ զոնդերը հիբրիդացվում են քրոմոսոմային ԴՆԹ-ի հետ, և մի քանի զոնդերը կարող են միաժամանակ օգտագործվել տարբեր տեղամասերում:

FISH-ը ցիտոգենետիկ վերլուծության օգտակար և զգայուն մեթոդ է քանակական և որակական քրոմոսոմային շեղումների հայտնաբերման համար, ինչպիսիք են ջնջումները (ներառյալ միկրոջնջումները), տրանսլոկացիաները, կրկնապատկումը և անեվպլոիդը: FISH ինտերֆազային քրոմոսոմների վրա ծառայում է արագ մեթոդ 21, 18 կամ 13 քրոմոսոմների վրա տրիզոմիայի նախածննդյան ախտորոշում կամ սեռական քրոմոսոմների շեղումներ: Ուռուցքաբանության մեջ FISH-ը կարող է հայտնաբերել արյունաբանական չարորակ նորագոյացությունների հետ կապված մի շարք տրանսլոկացիաներ: Մեթոդը կարող է օգտագործվել նաև քիմիաթերապիայից և ոսկրածուծի փոխպատվաստումից հետո քաղցկեղի մնացորդային ազդեցությունները վերահսկելու և որոշ ուռուցքների վատ կանխատեսման հետ կապված ուժեղացված օնկոգենները հայտնաբերելու համար: FISH-ը նաև օգտագործվում է հակառակ սեռի անհատից ստացված ոսկրածուծի ալոտրանսպլանտի գոյատևման մոնիտորինգի համար: FISH-ը նաև օգտագործվում է հյուսվածքային նմուշում հատուկ mRNA-ներ հայտնաբերելու և տեղորոշելու համար: Վերջին դեպքում FISH մեթոդը հնարավորություն է տալիս բջիջներում և հյուսվածքներում հաստատել գեների էքսպրեսիայի տարածական ժամանակային առանձնահատկությունները։

FISH-ը զգայուն մեթոդ է քրոմոսոմային շեղումները հայտնաբերելու և մեծ (>500) բջիջների միանգամից արագ վերլուծության համար: Մեթոդը շատ ճշգրիտ է քրոմոսոմների բնույթը և քրոմոսոմային ԴՆԹ-ի անհայտ բեկորները բացահայտելու համար:

Այսպիսով, ընդհանուր ձև FISH կարգավորելու արձանագրությունը կարող է ներկայացվել հետևյալ կերպ.

1) Հյուսվածքաբանական կամ բջջաբանական պատրաստուկի պատրաստում

Հյուսվածքաբանական պատրաստուկի պատրաստումն իրականացվում է ստանդարտ սխեմայի համաձայն՝ կտրում, գծանշում, լարում, լցնում, միկրոտոմիա, կտրվածքի տեղադրում ապակե սլայդի վրա և դեպարաֆինացում: Ցիտոլոգիական պատրաստուկ պատրաստելիս օգտագործվում են հատուկ նստեցնող լուծույթներ և ցենտրիֆուգացիա, ինչը հնարավորություն է տալիս ստանալ խտացված բջիջների կասեցում։

2) Նախնական մշակում (անհրաժեշտության դեպքում)

Պատրաստուկը մշակվում է պրոթեզերոններով՝ վերացնելու հիբրիդացմանը խոչընդոտող սպիտակուցների առկայությունը:

3) ԴՆԹ-ի հետաքննության կիրառում պատրաստման վրա և հետագա դենատուրացիա

Զոնդը և նմուշի ԴՆԹ-ն դենատուրացիայի ենթարկելու համար դրանք մշակվում են ֆորմամիդով և տաքացվում մինչև 85–90°C ջերմաստիճան:

4) Հիբրիդացում

Դենատուրացիայից հետո դեղը սառչում է որոշակի ջերմաստիճանի (դեպքում՝ 37ºС): կլինիկական հետազոտություն) և ինկուբացվում է խոնավ խցիկում մի քանի ժամով (ինկուբացիայի տևողությունը նշված է յուրաքանչյուր կոնկրետ արձանագրության մեջ): Ներկայումս ավտոմատ հիբրիդիզատորները օգտագործվում են դենատուրացիայի և հիբրիդացման համար:

5) ողողում.

Հիբրիդացման ավարտից հետո չկապված զոնդերը պետք է լվացվեն, ինչը հակառակ դեպքում կստեղծի ֆոն, որը դժվարացնում է FISH արդյունքների գնահատումը: Լվացման համար սովորաբար օգտագործվում է ցիտրատ և նատրիումի քլորիդ (SSC) պարունակող լուծույթ:

6) Մեջքի ներկում

Լյումինեսցենտային ներկերի օգնությամբ (DAPI - 4,6-diamidin-2-phenylindole; propidium iodide) ներկվում է ողջ միջուկային ԴՆԹ-ն։

7) Արդյունքների վերլուծություն լյումինեսցենտային մանրադիտակի միջոցով

Հատկապես կարևոր է մարդու գենոմի ուսումնասիրության վաղ փուլերում այն ​​մեթոդը, որը կոչվում է սոմատիկ բջիջների հիբրիդացում. Երբ մարդու սոմատիկ (ոչ սեռական) բջիջները խառնվում են այլ կենդանիների տեսակների բջիջների հետ (առավել հաճախ այդ նպատակով օգտագործվել են մկների կամ չինական համստերների բջիջները), որոշ գործակալների առկայության դեպքում նրանց միջուկները կարող են միաձուլվել (հիբրիդացում): Նման հիբրիդային բջիջների վերարտադրության ժամանակ որոշ քրոմոսոմներ կորչում են։ Բարեբախտաբար փորձարարների համար, մարդ-մկան հիբրիդային բջիջները կորցնում են մարդու քրոմոսոմների մեծ մասը: Այնուհետև ընտրվում են հիբրիդներ, որոնցում մնում է միայն մեկ մարդու քրոմոսոմ: Նման հիբրիդների ուսումնասիրությունները հնարավորություն են տվել կապել որոշ կենսաքիմիական հատկություններ, բջջայինմարդ, որոշակի մարդկային քրոմոսոմներով: Աստիճանաբար, ընտրովի միջավայրերի կիրառմամբ, նրանք սովորեցին հասնել որոշակի գեների կրող առանձին մարդկային քրոմոսոմների պահպանման կամ կորստի:

Բջիջների միաձուլումը հեշտացնելու համար տարբեր տեսակներՄշակման միջավայրին ավելացվում է ուլտրամանուշակագույն ճառագայթմամբ անակտիվացված Սենդայի վիրուս կամ պոլիէթիլեն գլիկոլ: Մարդու և մկան սկզբնական բջիջներից միաձուլվող բջիջներ ընտրելու համար բջիջները աճեցվում են հատուկ ընտրովի միջավայրի վրա, որը թույլ է տալիս միայն հիբրիդային բջիջներին բազմանալ:

Մինչ օրս քրոմոգեն in situ հիբրիդացում ավելի մատչելի մեթոդ է, քան լյումինեսցենտը: Երբ խոսքը վերաբերում է լյումինեսցենտային in situ հիբրիդացմանը, ԴՆԹ-ի զոնդը միացված է լյումինեսցենտային պիտակի հետ: Նման ուսումնասիրության արդյունքները գնահատվում են լյումինեսցենտային մանրադիտակի տակ: Քրոոգեն in situ հիբրիդացման դեպքում ԴՆԹ-ի զոնդը միացվում է պերօքսիդազի կամ այլ բանի հետ և ներկվում քրոմոգենով։ Այս դեպքում արդյունքները գնահատվում են սովորական լուսային մանրադիտակով:

ü FISH մեթոդի առավելությունները

Ինչպես հիմնական առավելությունները FISH-ը կարելի է առանձնացնել հետևյալ կերպ.

1) ինտերֆազային միջուկներում գենետիկական նյութի ուսումնասիրության հնարավորությունը.

2) օբյեկտիվ արդյունքների ձեռքբերում «այո / ոչ» սկզբունքով - սա քանակական մեթոդ է.

3) արդյունքների համեմատաբար պարզ մեկնաբանություն;

4) բարձր լուծում:

ü FISH մեթոդի թերությունները

1) լյումինեսցենտային ներկերը արագ «մարում են»;

2) Արդյունքները վերլուծելու համար պահանջվում է բարձրորակ լյումինեսցենտային մանրադիտակ:

FISH-ը (fluorescence in situ hybridization) քաղցկեղի ախտորոշման անփոխարինելի մեթոդ է: Հատուկ լյումինեսցենտային զոնդերի օգնությամբ այս մեթոդը հնարավորություն է տալիս բացահայտել գենոմային վերադասավորումների առկայությունը, այսինքն՝ պարզել ախտորոշումը, հստակեցնել կանխատեսումը և ընտրել համապատասխան թերապիա՝ կախված կոնկրետ դեպքից: Այս մոտեցումն առաջին հերթին կիրառվում է օնկոհեմատոլոգիական հիվանդությունների դեպքում։ Նախկինում այս նպատակների համար օգտագործվում էր սովորական կարիոտիպավորում, բայց եթե հիվանդի բջիջները մշակույթի մեջ ընդգծված աճ չեն ցույց տալիս, դա լրջորեն բարդացնում է այս մեթոդով ախտորոշումը: Այս դեպքերում FISH-ի օգտագործումը զգալիորեն ընդլայնում է լաբորատոր ախտորոշման հնարավորությունները։ Բացի այդ, բարդ քրոմոսոմային վերադասավորումներն ավելի հեշտ են մեկնաբանել FISH-ի միջոցով:

Լաբորատորիան օգտագործում է զոնդեր ցենտրոմերների, քրոմոսոմների հատուկ շրջանների և գեների համար: Երկգույն զոնդերն ընտրվում են փոխատեղումների որոնման համար այնպես, որ եթե մոտակայքում են երկու գեների բեկորներ, որոնք սովորաբար գտնվում են գենոմի տարբեր մասերում, ապա տարբեր գույների երկու ազդանշաններ՝ յուրաքանչյուր զոնդից մեկը, միաձուլվում են մեկի մեջ, որը տարբերվում է լույս օրիգինալից. Այսպես, օրինակ, հայտնաբերվել են տարբեր տեսակի լեյկոզների շրջանում տարածված BCR-ABL տրանսլոկացիաներ: Գեները, ինչպիսիք են MLL, TEL և RARα-ն, կարող են վերադասավորվել՝ ձևավորելով տարբեր հաջորդականությամբ քիմերային գեներ: Այս դեպքում երկու զոնդ են մոտենում գենի տարբեր ծայրերին։ Եթե ​​գենը անձեռնմխելի է, ապա պատրաստուկի վրա յուրաքանչյուր միջուկում կլինի մեկ կետ, եթե այն կոտրված է, ապա կլինեն երկու տարբեր գույների կետեր: Դրա շնորհիվ FISH-ը քրոմոսոմային տրանսլոկացիաների հայտնաբերման ավելի ճկուն տեխնիկա է, քան PCR-ը: Զոնդը կտեղակայվի քրոմոսոմի վրա՝ անկախ նրանից, թե կոնկրետ ինչպես է տեղի ունեցել մեկ այլ քրոմոսոմի մի հատվածի կոտրումը և կցումը որևէ կոնկրետ տարածաշրջանում՝ ի տարբերություն ՊՇՌ-ում օգտագործվող օլիգոնուկլեոտիդների, որոնք ճանաչում են հատուկ, թեև սովորական, վերադասավորումներ:

FISH-ի կողմից հայտնաբերված մարկերների վահանակը թույլ է տալիս գնահատել կանխատեսումը քրոնիկ լիմֆոիդ լեյկոզով: 11q և 17p ջնջումները կապված են վատ կանխատեսման հետ, մինչդեռ 13q ջնջումը, ինչպես նորմալ կարիոտիպը, կապված է բարենպաստ կանխատեսման հետ: 12-րդ քրոմոսոմի տրիզոմիայի դեպքում դեպքը կարող է վերագրվել միջանկյալ ռիսկի խմբին:

Միելոմայի ռիսկի կատեգորիան նույնպես կապված է ջնջումների և տրանսլոկացիաների համակցության հետ, t(4;14), t(14;16) տրանսլոկացիաները և 17p ջնջումը կապված են վատ կանխատեսման հետ: Նման ախտորոշիչ հետազոտություններ կատարվում են կարմիր ոսկրածուծի բիոպսիաների վրա հարստացումից հետո։ Թեթև շրջադարձը, որն ուղեկցվում է քիմերային EML4-ALK գենի ձևավորմամբ, բնորոշ է թոքերի ոչ մանր բջջային քաղցկեղին: Քիմերիկ գենի արտադրանքը թիրախային թերապիայի թիրախ է: Նման վերադասավորումը կարող է հայտնաբերվել նաև FISH մեթոդով։ HER2 ուժեղացումը հաճախ գնահատվում է անուղղակի նշանով` արտահայտման մակարդակի բարձրացում, դրա համար օգտագործելով իմունոհիստոքիմիայի մեթոդը, սակայն որոշ երկրներում խորհուրդ է տրվում օգտագործել FISH այս նպատակով կամ գոնե օգտագործել այս մեթոդը հաստատման համար:

Ֆլուորեսցենտային in situ հիբրիդացում

Լյումինեսցենտային հիբրիդացում տեղում կամ FISH մեթոդը (eng. Լյումինեսցենտ տեղում հիբրիդացում - FISH ) - ցիտոգենետիկ մեթոդ, որն օգտագործվում է մետաֆազային քրոմոսոմների կամ միջֆազային միջուկներում ԴՆԹ-ի հատուկ հաջորդականության դիրքը հայտնաբերելու և որոշելու համար. տեղում. Բացի այդ, FISH-ն օգտագործվում է հյուսվածքային նմուշում հատուկ mRNA-ներ հայտնաբերելու համար: Վերջին դեպքում FISH մեթոդը հնարավորություն է տալիս բջիջներում և հյուսվածքներում հաստատել գեների էքսպրեսիայի տարածական ժամանակային առանձնահատկությունները։

Զոնդեր

Լյումինեսցենտային հիբրիդացումով տեղումօգտագործել ԴՆԹ-ի զոնդերը (ԴՆԹ-ի զոնդերը), որոնք կապվում են նմուշի լրացուցիչ թիրախներին: ԴՆԹ-ի զոնդերը պարունակում են նուկլեոզիդներ՝ պիտակավորված ֆտորոֆորներով (ուղիղ պիտակավորում) կամ կոնյուգատներով, ինչպիսիք են բիոտինը կամ դիգոքսիգենինը (անուղղակի պիտակավորում): Ուղղակի պիտակավորման դեպքում թիրախին կապված ԴՆԹ-ի զոնդը կարելի է դիտարկել հիբրիդացման ավարտից անմիջապես հետո լյումինեսցենտային մանրադիտակի միջոցով: Անուղղակի պիտակավորման դեպքում պահանջվում է ներկման լրացուցիչ ընթացակարգ, որի ընթացքում բիոտինը հայտնաբերվում է լյումինեսցենտային պիտակավորված ավիդինի կամ ստեպավիդինի միջոցով, իսկ դիգոքսիգենինը` ֆլյուորեսցենտային պիտակավորված հակամարմինների միջոցով: Թեև ԴՆԹ-ի նմուշների պիտակավորման անուղղակի տարբերակը պահանջում է լրացուցիչ ռեակտիվներ և ժամանակ, այս մեթոդը սովորաբար հասնում է ազդանշանի ավելի բարձր մակարդակի՝ հակամարմինների կամ ավիդինի մոլեկուլի վրա 3-4 ֆտորոքրոմ մոլեկուլների առկայության պատճառով: Բացի այդ, անուղղակի պիտակավորման դեպքում հնարավոր է ազդանշանի կասկադային ուժեղացում։

ԴՆԹ-ի նմուշներ ստեղծելու համար օգտագործվում են կլոնավորված ԴՆԹ-ի հաջորդականություններ, գենոմային ԴՆԹ, ՊՇՌ ռեակցիայի արտադրանք, պիտակավորված օլիգոնուկլեոտիդներ և միկրոդիսեկցիայով ստացված ԴՆԹ:

Զոնդի պիտակավորումը կարող է իրականացվել տարբեր ձևերով, օրինակ՝ մակագրված նուկլեոտիդների միջոցով, օրինակ՝ մակագրված նուկլեոտիդներով:

Հիբրիդացման կարգը

Լյումինեսցենտային հիբրիդացման փորձի սխեման տեղումտեղայնացնել գենի դիրքը միջուկում

Առաջին քայլը զոնդերի նախագծումն է: Զոնդի չափը պետք է լինի բավական մեծ, որպեսզի հիբրիդացումը տեղի ունենա կոնկրետ տեղամասում, բայց ոչ շատ մեծ (ոչ ավելի, քան 1 կբ), որպեսզի չխանգարի հիբրիդացման գործընթացին: Հատուկ տեղամասեր հայտնաբերելիս կամ ամբողջական քրոմոսոմներ ներկելիս անհրաժեշտ է արգելափակել ԴՆԹ-ի զոնդերի հիբրիդացումը ոչ եզակի կրկնվող ԴՆԹ-ի հաջորդականությամբ՝ ավելացնելով չպիտակավորված ԴՆԹ կրկնություններ (օրինակ՝ Cot-1 ԴՆԹ) հիբրիդացման խառնուրդին: Եթե ​​ԴՆԹ-ի զոնդը երկշղթա ԴՆԹ է, ապա հիբրիդացումից առաջ այն պետք է այլասերվի:

Հաջորդ փուլում պատրաստվում են միջֆազային միջուկների կամ մետաֆազային քրոմոսոմների պատրաստուկներ։ Բջիջները ամրացվում են սուբստրատի վրա, սովորաբար ապակե սլայդի վրա, որին հաջորդում է ԴՆԹ-ի դենատուրացիա: Քրոմոսոմների կամ միջուկների մորֆոլոգիան պահպանելու համար ֆորմամիդի առկայությամբ կատարվում է դենատուրացիա, ինչը հնարավորություն է տալիս դենատուրացիայի ջերմաստիճանը նվազեցնել մինչև 70°։

Կապված ԴՆԹ-ի զոնդերի վիզուալիզացիան իրականացվում է լյումինեսցենտային մանրադիտակի միջոցով: Լյումինեսցենտային ազդանշանի ինտենսիվությունը կախված է բազմաթիվ գործոններից՝ զոնդի պիտակավորման արդյունավետությունից, զոնդի տեսակից և լյումինեսցենտային ներկի տեսակից:

գրականություն

• Ռուբցով Ն.Բ. Կաթնասունների քրոմոսոմների հետ աշխատելու մեթոդներ՝ Պրոց. նպաստ / Novosib. պետություն un-t. Նովոսիբիրսկ, 2006. 152 էջ.

• Ռուբցով Ն.Բ. Նուկլեինաթթուների հիբրիդացում տեղումքրոմոսոմային անոմալիաների վերլուծության մեջ. «Մոլեկուլային ախտորոշման ներածություն» գրքի գլուխ 2. «Մոլեկուլային գենետիկական մեթոդները ժառանգական և ուռուցքաբանական հիվանդությունների ախտորոշման մեջ» / Էդ. Մ.Ա. Պալցևա, Դ.Վ. Զալետաև. Ուսումնական գրականություն բժշկական բուհերի ուսանողների համար. Մ.: Բժշկություն, 2011. T. 2. S. 100–136.

Նշումներ

Վիքիմեդիա հիմնադրամ. 2010 թ .

Տեսեք, թե ինչ է «Fluorescent in situ հիբրիդացումը» այլ բառարաններում.

Այս տերմինն այլ իմաստներ ունի, տես հիբրիդացում։ ԴՆԹ-ի հիբրիդացում, նուկլեինաթթուների հիբրիդացում in vitro կոմպլեմենտար միաշղթա նուկլեինաթթուների համակցություն մեկ մոլեկուլի մեջ։ Ամբողջական փոխլրացումով ... ... Վիքիպեդիա

In situ հիբրիդացման հնարավորությունները կարող են մեծապես ընդլայնվել բազմաթիվ լյումինեսցենտային գույների միաժամանակյա օգտագործմամբ: Բազմագույն ֆլուորեսցենտային in situ հիբրիդացումը (FISH) իր ամենապարզ ձևով կարող է օգտագործվել բազմաթիվ բնութագրեր պիտակավորելու համար, քանի որ հիբրիդացման ժամանակ օգտագործվում են տարբեր ֆտորոֆորներ: Օգտագործելով գունային համակցություններ, այլ ոչ թե մեկ գույներ, թվային պատկերման մանրադիտակները կարող են միաժամանակ հայտնաբերել ներկով արտահայտված շատ ավելի շատ բնութագրեր առանձին բջիջներում:

Բրինձ. 1. Բազմագույն ՁՈՒԿ

Օպտիկական համակարգերի և հարակից սարքավորումների համաշխարհային խոշոր արտադրողների ֆլուորեսցենտային մանրադիտակների հետ մանրամասն ծանոթանալու համար այցելեք մեր կատալոգ կամ դիմեք մեր մասնագետներին և ստացեք լիարժեք մասնագիտական ​​խորհրդատվություն ձեր ցանկացած հարցի վերաբերյալ:

Նկար 1-ը ցույց է տալիս տիպիկ բազմագույն լյումինեսցենտային հիբրիդացում՝ FISH օրինակ: Արական նորմալ լիմֆոցիտները հիբրիդացվել են FITC-բիոտինով ներկված Chr2l և ChrY զոնդերով և CY3-digoxigenin ներկված Chrl3 և ChrY զոնդերով: Վերևի ձախ - DAPI-ով ներկված ԴՆԹ միջուկներ, որոնք ստացվել են DAPI ֆիլտրով: Վերևի աջում Chr2l-ի և ChrY-ի FITC ներկված պատկերն է, որը ստացվել է FITC զտիչով: Ներքևի ձախ - Chrl3 և ChrY ներկված CY3-ով, ստացված CY3 ֆիլտրի միջոցով: Ներքևի աջ պատկերը կոմպոզիտային պատկեր է, որը ցույց է տալիս թիրախային բոլոր քրոմոսոմները գունավոր: Այս նմուշը տրամադրվել է դոկտոր Թիմ Հաուսլի կողմից, Integrated Genetics, Framingham, Massachusetts:

Multicolor FISH տեխնիկան, որը զուգորդվում է թվային պատկերավորման տեխնիկայի հետ, այժմ առաջարկում է նուկլեինաթթուների բազմաթիվ հաջորդականությունների անզուգական ոչ իզոտոպային հայտնաբերում բջիջների բաղադրիչների, քրոմոսոմների և գեների վերլուծության համար:

Ֆլյուորեսցենցիան - մի երևույթ, որի դեպքում քիմիական միացությունը գրգռվում է լույսի մի ալիքի երկարությամբ և արտանետվում մեկ այլ ալիքի վրա, սովորաբար ավելի երկար, օգտագործվում է բոլոր կենսաբանական գիտություններում՝ տարբեր կառուցվածքների և ներբջջային գործընթացների ուսումնասիրության համար: Ներկանյութերի և մանրադիտակների մշակման տեխնոլոգիական առաջընթացը վերջին տասնամյակում հանգեցրել է ֆլյուորեսցենտային մեթոդների արագ զարգացմանը:

Այս վերանայման հոդվածը կուրվագծի FISH մեթոդի հիմունքները, FISH-ի տարիների ընթացքում հետազոտողների բախվող սահմանափակումները, սարքավորումների, ծրագրաշարի, ներկերի և ռեակտիվների վերջին զարգացումները, որոնք ազդել են այս մեթոդի զարգացման վրա և այս ոլորտում առկա միտումները: Այս մեթոդի վերջին ձեռքբերումները, որոնք հանգեցրել են դրա կիրառմանը ոչ միայն հետազոտական ​​լաբորատորիաներում, այլև կլինիկական ախտորոշման մեջ, նույնպես կքննարկվեն այս հոդվածում:

FISH մեթոդի ակնարկ

FISH-ի կիրառումը արագորեն աճում է գենոմիկայի, ցիտոգենետիկայի, նախածննդյան հետազոտությունների, նորագոյացությունների կենսաբանության, ռադիոակտիվ պիտակավորման, գեների քարտեզագրման, գեների ուժեղացման և հիմնական կենսաբժշկական հետազոտությունների ոլորտներում: Սկզբունքորեն, այս մեթոդը բավականին պարզ է.

Հիբրիդացումը նույնացնում կամ նշում է թիրախային գենոմային հաջորդականությունները, որպեսզի հնարավոր լինի դիտարկել դրանց գտնվելու վայրը և չափը: ԴՆԹ-ի կամ ՌՆԹ-ի հաջորդականությունները համապատասխան, կախված քրոմոսոմից, զոնդերը սկզբում պիտակավորվում են ռեպորտաժային խմբերով, որոնք հետագայում հայտնաբերվում են ֆլյուորեսցենտային մանրադիտակի միջոցով: Նշված ԴՆԹ-ի կամ ՌՆԹ-ի զոնդն այնուհետև հիբրիդացվում է մետաֆազային քրոմոսոմների կամ ապակե սլայդի վրա հանգստացող միջուկների հետ: Ազդանշանը լվանալուց և ուժեղացնելուց հետո նմուշը հետազոտվում է լրագրողական խմբերի համար՝ օգտագործելով լյումինեսցենտային մանրադիտակ:

FISH-ը հնարավորություն է տալիս հասնել մորֆոլոգիական և գենոմային կառուցվածքների շատ բարձր տարածական լուծման: Այս մեթոդը բավականին արագ է, հեշտ իրագործելի և բնութագրվում է ներկերի բարձր կայունությամբ։ Կախված օգտագործվող զոնդից՝ հնարավոր է որոշել անհատի գենոմը, ամբողջական քրոմոսոմները, քրոմոսոմների հատվածները և եզակի կրկնօրինակների հաջորդականությունը։

Նախկին սահմանափակումներ

Մինչև վերջերս FISH-ը սահմանափակված էր ապարատային, ծրագրային ապահովման, ռեակտիվների, ներկերի տեխնոլոգիայի և կատարման բարձր ծախսերի պատճառով: Առևտրային հասանելի մանրադիտակի ապարատը, որը օպտիմիզացված էր բազմագույն FISH-ի համար, հասանելի չէր մինչև 1990-ականների կեսերը: Մինչ այդ մանրադիտակները պետք է հատուկ կարգավորվեին FISH կիրառությունների համար: Մանրադիտակային օպտիկաներից շատերը նախատեսված չեն FISH-ին բնորոշ ցածր մակարդակի լուսային ազդանշանները հայտնաբերելու համար: Քանի որ գենոմների լուծումը զգալիորեն բարելավվել է այս մեթոդի կիրառմամբ, միկրոսկոպիկ օպտիկայի պահանջները նույնպես մեծացել են: Խնդիր էին ներկայացնում նաև բազմաթիվ ալիքների երկարությունների քրոմատիկ շեղումները: Հատկապես բազմագույն վերլուծության համար բոլոր ոսպնյակները, ներառյալ կոնվերգենտ ոսպնյակը, պետք է ուղղվեին քրոմատիկ շեղումների համար: Բացի այդ, շատ դժվար էր կարգավորել էպիֆլյուորեսցենտային լույսերը՝ միատեսակ լուսավորություն ստանալու համար:

Բազմագույն FISH պատկերների վերլուծությունը պահանջում է տարբեր ազդանշանների տարանջատում կամ (ա) առանձին ֆիլտրի խորանարդներով կամ (բ) օգտագործելով գրգռման ֆիլտրի զանգված՝ լայնաշերտ երկշերտ և շեմային զտիչներով: Ֆիլտրի տեխնոլոգիայի զարգացումը շտկել է նախկինում առաջացած որոշ խնդիրներ, որոնք առաջացել են օպտիկական սխալ դասավորության և առանձին ֆիլտրերի խորանարդների միջև մեխանիկական անցման հետևանքով առաջացած սխալ դիրքի պատճառով: Փոխարինելի գրգռիչ ֆիլտրերը, որոնք օգտագործվում են բազմաշերտ երկխրոնիկ և շեմային ֆիլտրերով, կարող են արդյունավետ աշխատել երեք գույների հետ՝ օգտագործելով առանձին գրգռման զտիչներ յուրաքանչյուր գույնի համար՝ առանց տեղաշարժի հայտնաբերման: Բայց երեքից ավելի գույների հետ աշխատելիս դուք դեռ պետք է օգտագործեք մեկ ժապավենի ֆիլտրեր:

Տվյալների հավաքագրման համար օգտագործվել է գերարագ գունավոր ֆիլմ կամ CCD (Charge-Coupled Device), և երկու դեպքում էլ գունային ճշգրտության հետ կապված խնդիրներ են եղել։ Բացի այդ, խնդիրներ կային միևնույն նմուշից վերցված տարբեր գույների պատկերների համընկնման հետ կապված տարբեր ներկերի զոնդերի միջոցով:

Լյումինեսցենտային ռեագենտներով պատրաստված նմուշների քանակական վերլուծության ծրագրակազմը նույնպես շատ ցանկալի էր թողել, քանի որ պատկերի վերլուծության առկա համակարգերը օպտիմիզացված չէին լյումինեսցենտային նմուշների հետ աշխատելու համար: Տեսողական անալիզը ժամանակատար և հաճախ սուբյեկտիվ պրոցեդուրա է, ուստի առանց առաջադեմ ֆլյուորեսցենտային պատկերման օգտագործման, լյումինեսցենտային նմուշների վերլուծությունը դժվար և երկիմաստ էր: Հետազոտողները սովորաբար պետք է աշխատակազմում ունենային իրենց ծրագրավորողները՝ պատկերների վերլուծության իրենց սեփական ծրագրերը մշակելու համար:

Միայն ռեակտիվները և ներկանյութերը բավարար չէին բոլոր կիրառությունների համար: Օրինակ, հիբրիդացման տեղակայման արդյունավետությունը նվազել է զոնդի չափի նվազման հետ, ինչը խիստ սահմանափակել է նմուշները, որոնք կարելի էր դիտարկել ֆլյուորեսցենտային մանրադիտակով: Տարբեր լյումինեսցենտային ներկերի քանակը սահմանափակ էր. բացի այդ, նրանք ունեին ցածր ֆոտոկայունություն: Սակայն ֆլյուորեսցենտային ներկերի տեխնոլոգիայի և հարակից տեխնոլոգիաների զարգացումը դաշնային կողմից ֆինանսավորվող Մարդու գենոմի նախագծի շրջանակներում այժմ տալիս է իր պտուղները: Մարդու բոլոր քրոմոսոմների համար զոնդերն արդեն գոյություն ունեն, և առկա գենային զոնդերի թիվը նույնպես աճում է: In situ հիբրիդացման հավաքածուները և լյումինեսցենտային պիտակավորված զոնդերը այժմ կոմերցիոն հասանելի են մի քանի ընկերություններից:

Գինը ևս մեկ կարևոր խոչընդոտ էր: Քանի որ շուկայում չկար առևտրային հասանելի FISH համակարգեր, հետազոտողները ստիպված էին հավաքել հատուկ պատրաստված համակարգեր, ներառյալ ռեակտիվներ, զոնդեր, մանրադիտակներ, պատկերներ, տվյալների վերլուծություն և հաշվետվությունների սարքավորում և ծրագրակազմ: Պատկերների բարդ վերլուծությամբ բազմագույն FISH-ի անցկացումը կարող է քննիչին արժենալ ավելի քան 200,000 դոլար, մի գումար, որը դժվար է հասնել կլինիկական հետազոտողների մեծամասնության համար: Արդյունքում, շատ հետազոտողներ, ովքեր ցանկանում են օգտագործել FISH-ը իրենց լաբորատորիաներում, չեն կարողացել դա անել:

FISH-ը լայն տարածում է գտել

Սարքավորումների և ծրագրային ապահովման շատ արտադրողներ մշակել են մատչելի մատչելի համակարգեր՝ որպես սովորական համակարգերի այլընտրանք: Համագործակցային մթնոլորտը, որը ձևավորվել է FISH-ում ներգրավված բազմաթիվ ֆիրմաների և լաբորատորիաների միջև, հանգեցրել է նոր բեկումների այս ոլորտում: Իսկ հրատարակված աշխատանքների հեղինակներն իրենց ձեռքբերումները դիտարկում են հենց նման համագործակցության շրջանակներում։

Բրինձ. 2. MultiFluor օպերացիոն էկրան

Համակարգը, որը գործում է Միացյալ Նահանգներում և ապահովում է միջին գներ առևտրային հասանելի FISH հետազոտական ​​համակարգերի համար, միավորում է բազմաթիվ արտադրողների բաղադրիչները և հիմնված է պատկերների մշակման ծրագրային ապահովման, մանրադիտակի սարքավորումների և այլ պարագաների վերջին առաջընթացների վրա: Կլինիկական հետազոտական ​​լաբորատորիաների համար այս համակարգը ապացուցում է, որ օգտակար է բազմաթիվ ծրագրերում: Լինելով ինտեգրված և ավտոմատացված՝ այն թույլ է տալիս ամբողջությամբ իրականացնել կլինիկական փորձարկումներ:

Այստեղ ներկայացված ծրագրային համակարգը MultiFluor™-ն է՝ բազմապարամետրային պատկերման համակարգ (Biology Research Systems), որը մշակվել է Microsoft® Windows-ում (Microsoft Corporation, Bellevue, Վաշինգտոն)՝ բազմագույն FISH նմուշներից ստացված կառուցվածքային և մոլեկուլային բնութագրերի հայտնաբերման, վերլուծության և ներկայացման համար։ . Վերլուծության ժամանակը և արդյունքների ճշգրտությունը բարելավվում են՝ յուրաքանչյուր նմուշում տարբեր ալիքի երկարությունների վրա բազմաթիվ հատկանիշներ փոխկապակցելով: Այս համակարգը հեշտացնում է պատկերների ստացումը, պահպանումը, տվյալների բազայի կառավարումը, ավտոմատացված մանրադիտակի կառավարումը և ամբողջական գրաֆիկական տվյալների վերլուծությունը:

Նկար 2-ը ցույց է տալիս MultiFluor տվյալների ընդհանուր էկրանը: Օգտատերերը կարող են դիտել պատկերները և դրանց առնչվող տվյալները և համեմատել տարբեր գույներով (տարբեր ալիքի երկարություններով) ստացված բազմապարամետրային տվյալները՝ օգտագործելով գծագրման տարբեր գործիքներ, ներառյալ հիստոգրամներ, ցրված սյուժեներ և այլն: գունավոր բջիջների պատկերներ (պատկերում են DAPI միջուկները, FITC-ChrX, CY3-ChrY և CY5-Chr2l), ինչպես նաև աղյուսակում ներկայացված բազային տվյալները:

FISH հետազոտողները կարող են ինքնաբերաբար ձեռք բերել պատկերներ տարբեր ալիքների երկարությամբ տարբեր կիզակետային հարթություններում, պատկերացնել բազմագույն FISH զոնդերը, ծանոթագրել և տպել պատկերներ, պահել և առբերել մեծ քանակությամբ բազմագույն պատկերների տվյալների հավաքածուներ: Multicolor FISH մետաֆազային քրոմոսոմները կարող են վերլուծվել գեների քարտեզագրման, համեմատական ​​գենոմային հիբրիդացման (CGH) և կարիոտիպի առաջացման միջոցով: Օգտագործողի կողմից ընտրված նմուշի տարածքները կարող են սկանավորվել և վերլուծվել: Ծրագիրը ավտոմատ կերպով կենտրոնացնում է համակարգը, ձեռք է բերում պատկերներ մի քանի ալիքի երկարությամբ, հիշում է բջիջների դիրքը ապակու սլայդի վրա և չափում է տարբեր բնութագրեր, ներառյալ զոնդերի քանակը, լյումինեսցենցիայի ինտենսիվությունը և բջջային մորֆոմետրիան: Տարբեր ալիքների երկարության տարբեր բնութագրեր կարող են փոխկապակցված լինել միմյանց հետ:

Համակարգի լրացուցիչ հատկանիշը ցանցին միացված անհատական ​​համակարգիչների (ՀՀ) հետ աշխատելու հնարավորությունն է: Տիպիկ կոնֆիգուրացիայի դեպքում մեկ համակարգիչը առցանց կայան է, որը միացված է տեսախցիկի և մանրադիտակի սարքավորումներին: Այս համակարգիչը վերահսկում է պատկերների ստացումը և կատարում է ակնթարթային վերլուծություն: Այլ ԱՀ-ները տեղեկատվության վերլուծության երկրորդական կայաններ են, որտեղ մշակվում են առաջին ԱՀ-ից ստացված տվյալները, կամ որտեղ որոշ հատուկ վերլուծություններ կատարվում են ինքնուրույն:

Ծրագիրը թույլ է տալիս բոլոր բաղադրիչները ներկայացնել վառ կեղծ գույներով՝ միաժամանակ բազմագույն վիզուալիզացիայի համար: Օրինակ, չորս գույնի փորձի միաժամանակյա պատկերները (օգտագործելով DAPI (կապույտ), FITC (կանաչ), CY3 (կարմիր) և FITC-CY3 (դեղին) համադրություն) կարող են ներկայացվել առանձին կամ միավորվել մեկ պատկերի մեջ (ինչպես ցույց է տրված Նկար 1-ում): Յուրաքանչյուր պատկեր կարող է ինտերակտիվ կերպով կատարելագործվել՝ ընդգծելու համար հետաքրքրող հատկանիշները: Օգտագործելով ծրագիրը, հեշտ է ստեղծել հիստոգրամներ, ցրված սյուժեներ, աղյուսակներ, գծային գրաֆիկներ և տվյալների ներկայացման և գնահատման այլ ձևեր (Նկար 2): Բացի այդ, տվյալները պահվում են հեշտությամբ մատչելի և հայտնի ձևաչափերով, ինչպիսիք են TIFF, JPEG, GIF և այլն:

Ուռուցքաբանական, նախածննդյան և կենսաբանական հետազոտություններ

FISH-ի կողմից նկարագրված համակարգերը նախագծված են քննիչների համար ավելի հասանելի լինելու համար, քան նախկին պատվերով պատրաստված համակարգերը: Դրանք ավելի ու ավելի են օգտագործվում ուռուցքաբանության, պաթոլոգիայի, ցիտոգենետիկայի և զարգացման կենսաբանության մեջ: Դրանց կիրառություններից են ինտերֆազային բջիջների վերլուծությունը բազմագույն ներկերով նկատված բծերի քանակով, իմունոֆենոտիպավորումը, բջիջների մորֆոմետրիան և ԴՆԹ-ի կազմը:

Այս համակարգերը վերլուծում են քրոմոսոմների կրկնօրինակների քանակի շեղումները՝ կապված ԴՆԹ-ի ընդհանուր կազմի հետ, որոնք կապված են ուռուցքների առաջացման հետ։ Միզապարկ. Նախածննդյան հետազոտություններում այս համակարգերը կարող են օգտագործվել հանգստի միջուկներում անեուպլոիդներ հայտնաբերելու համար, որոնք կապված են նախածննդյան արատների հետ, ներառյալ Դաունի համախտանիշը, Թերների համախտանիշը, Կլայնֆելտերի համախտանիշը և այլն: Բջջային և զարգացման կենսաբանության մեջ այս համակարգը կարող է օգտագործվել բջջային մակերևույթի մարկերների և դրանց հարաբերական բաշխման քարտեզագրման համար, ինչպիսիք են ընկալիչները, ցիտոպլազմային մարկերները, ներառյալ ցիտոկմախքի սպիտակուցները, սուրհանդակային ՌՆԹ-ները և հատուկ գեները:

Ախտորոշիչ ներուժ

Վերջին մեկուկես տասնամյակի ընթացքում պարզ դարձավ, որ FISH մեթոդը հսկայական ներուժ ունի ոչ միայն որպես հետազոտական ​​աշխատանքի գործիք, այլ նաև կլինիկական ախտորոշման այնպիսի ոլորտներում, ինչպիսիք են նախածննդյան ախտորոշումը, ցիտոգենետիկան և ուռուցքի զարգացումը: Բարձրորակ, մատչելի համակարգերի բացակայությունը ոչ միայն խոչընդոտեց FISH-ի տարածմանը հետազոտողների շրջանում, այլև անհասանելի դարձրեց այս մեթոդը բազմաթիվ բժշկական հաստատությունների ախտորոշիչ կենտրոնների համար:

Արդյունքներ, որոնք նախկինում կարելի էր ձեռք բերել միայն թանկարժեք, պատվերով պատրաստված սարքավորումներով, այժմ կարելի է ձեռք բերել այս համակարգի միջոցով, և սա նրա ամենակարևոր առավելություններից մեկն է: FISH-ը ոչ միայն կենսաբժշկական հետազոտությունների ավելի լայն շրջանակում կիրառելու, այլ այն ուղղակիորեն հիվանդների ծառայության մեջ դնելու երազանքը կարող է իրականություն դառնալ ոչ այնքան հեռավոր ապագայում:

Ֆլյուորեսցենտային ստերեոմիկրոսկոպիա

Էպիֆլյուորեսցենտային լուսավորություն

Մինչև վերջերս լյումինեսցենտային լուսավորությունը հասանելի էր միայն հետազոտական ​​մանրադիտակների վրա, որոնք հագեցած էին հատուկ բարձր բացվածքով օբյեկտներով: Այս տեխնիկայում ստերեոմիկրոսկոպիայի անհրաժեշտությունը մեծացել է գենետիկորեն կոդավորված և կենսաբանորեն հատուկ լյումինեսցենտ սպիտակուցների հայտնվելով, ինչպիսին է GFP-ն (Կանաչ ֆլուորեսցենտային սպիտակուցը):

Բրինձ. 1. Ստերեոմիկրոսկոպ էպիֆլյուորեսցենտ լուսատուով

Ստերեոմանրադիտակների օգտագործումը GFP-ի դիտարկման համար այնքան տարածված է, որ ստերեո լյումինեսցենտ լուսավորիչներն ավելի հաճախ կոչվում են GFP լուսատուներ, չնայած այն հանգամանքին, որ դրանք կարող են օգտագործվել բազմաթիվ այլ ծրագրերում, ինչպես կենսաբանական գիտությունների, այնպես էլ էլեկտրոնիկայի արդյունաբերության մեջ: Խոշոր նմուշները, ինչպիսիք են թրթուրները, նեմատոդները, զեբրաձուկը, ձվաբջիջները և հասուն միջատները, հեշտ է դիտարկել (և հեշտ է մանիպուլյացիայի ենթարկել), երբ ներկված են GFP-ով և լուսավորվում են լյումինեսցենտային լույսով: Լյումինեսցենտային լուսավորությունը բացահայտում է, թե որ օրգանիզմներն են արտադրում լյումինեսցենտային սպիտակուցը, և ստերեոսկոպիկ դիտարկումը, որը զուգորդվում է մեծ տեսադաշտի և երկար աշխատանքային հեռավորության հետ, թույլ է տալիս դիտորդին օգտագործել պինցետներ, պիպետներ կամ միկրոմանիպուլյատորներ փորձի ընթացքում: Այլ, ավելի բնորոշ նմուշները նույնպես հեշտ է հետազոտել՝ օգտագործելով լյումինեսցենտային լուսավորությամբ ստերեոմիկրոսկոպներ:

Ստերեոմիկրոսկոպի վրա էպիֆլյուորեսցենտային լուսավորիչը գործում է այնպես, ինչպես ավելի բարդ մանրադիտակներում հայտնաբերվածները: Սովորաբար, լյումինեսցենտային լուսավորիչը քսենոնային կամ սնդիկի աղեղային լամպ է, որը տեղադրված է արտաքին լուսատուի մոնտաժում, որը միացված է մանրադիտակին միջանկյալ խողովակի միջոցով (կամ ուղղահայաց լուսավորիչ, տես Նկարներ 1 և 2), որը գտնվում է մանրադիտակի խոշորացման և ակնաչափ խողովակների միջև: Մինչ օրս լուսավորության այս տեսակը սահմանափակվում է սովորական ոսպնյակների (CMO) ստերեոմանրադիտակներով, քանի որ առևտրային հասանելի մասերը չեն կարող օգտագործվել Grenoux ստերեոմանրադիտակի կամ այլ կոնվերգենտ ստերեոմանրադիտակի ֆլյուորեսցենտային լույսի համար հարմարեցնելու համար:

Աղեղային լամպի արտանետվող լույսը ուղղվում է կարգավորվող համընկնող կոլեկտորային ոսպնյակի միջոցով դեպի գրգռման ֆիլտր, որը գտնվում է համակցված ֆիլտրի բլոկում (ինչպես ցույց է տրված Նկար 2-ում և 3-ում): Այս զտիչը լույս է փոխանցում միայն որոշակի ալիքի տիրույթում (թողունակություն): Լույսը, որն անցել է ֆիլտրի միջով, այնուհետև մանրադիտակի օպտիկական ուղու երկայնքով շեղվում է դեպի դրա ստորին հատվածը (մեծացման մոդուլը և օբյեկտը ստերեոմանրադիտակում) և ուղղվում դեպի նմուշ երկխրոնիկ հայելու միջոցով, որը, կախված կարգավորումից, արտացոլում է. , ընտրողաբար զտում և/կամ փոխանցում է սպեկտրի որոշակի երկարության ալիքների/տարածքների լույսը: Դիխրոիկ (կամ երկխրոմատիկ) տերմինը վերաբերում է ֆիլտրի կամ հայելու հատկությանը` «տարբերելու» ընկնող լույսի գույները՝ արտացոլելով գույնի լույսը, որն ընկնում է տվյալ ալիքի երկարության սահմանից ցածր և այդ սահմանից բարձր գույներ փոխանցելու միջոցով:

Բրինձ. 2. Ճառագայթների ուղին լյումինեսցենտ ստերեոմիկրոսկոպում

Գրգռման լույսի կենտրոնացված ճառագայթն անցնում է խոշորացման և ոսպնյակի միջով, որտեղ այն ձևավորում է շրջված լուսային կոն, որը ճառագայթում է նմուշը՝ առաջացնելով նմուշի բոլոր ֆտորոֆորների գրգռումը, որոնց կլանման գոտին համապատասխանում է ճառագայթող լույսի փոխանցման գոտուն: Նմուշից արտանետվող երկրորդական լյումինեսցենտ լույսը (սովորաբար ավելի երկար, քան գրգռման ալիքի երկարությունը) գրավվում է ստերեոմիկրոսկոպի ընդհանուր հիմնական նպատակի միջոցով և ուղղվում է խոշորացման միջով դեպի շեմային ֆիլտր, որը արգելափակում է լույսը գրգռման ալիքի երկարության վրա և թույլ է տալիս լույսը միայն արտանետվել: ալիքի երկարությունը, որով պետք է անցնի: Նկար 1-ում և 2-ում տրված մանրադիտակի խողովակը նախագծված է այնպես, որ լյումինեսցենտային արտանետումների ավելի երկար ալիքների երկարությունները, որոնք հետ են անցնում խոշորացման ձախ և աջ օպտիկական ալիքներով, կենտրոնացած են ինքնուրույն, նախքան դրանք հասնելը էպիֆլյուորեսցենտ լուսատուին: Ձախ ալիքից լույսն անմիջապես անցնում է շեմային ֆիլտրին, որից հետո այն ուղղվում է դեպի ակնափող խողովակները կամ դեպի ֆոտոպորտ: Ի հակադրություն, աջ ալիքի լույսը սկզբում ուղղվում է ետ՝ երկխոսական հայելու միջով, այնուհետև դեպի շեմային զտիչ և ակնոցներ: Այս լույսը ելք չունի դեպի տեսախցիկի միացք և կարող է օգտագործվել միայն նմուշի դիտարկման համար:

Լյումինեսցենտային համակցված ֆիլտրի բանկի կառուցման մանրամասները ներկայացված են Նկար 2-ում և 3-ում: Յուրաքանչյուր ափը պարունակում է մեկ ժապավենի գրգռման լույսի զտիչ, երկու շեմային զտիչներ և երկխրոնիկ հայելի: Սնդիկի աղեղային լամպի լույսը ներթափանցում է ֆիլտրի բլոկ գրգռման ֆիլտրի միջով և արտացոլվում է երկխրոնիկ հայելու մակերևույթից, ինչպես քննարկվել է վերևում և ինչպես ցույց է տրված Նկար 3-ում: Երկրորդային լյումինեսցենտային ճառագայթումն անցնում է շեմային ֆիլտրերի միջով: Ձախ ալիքի գրգռման ֆիլտրը, երկխրոնիկ հայելին և շեմային ֆիլտրը սոսնձված են համակարգի մեջ, իսկ աջ ալիքի շեմային ֆիլտրը ամրագրված է փոքր շրջանակի մեջ, որը կարելի է հեռացնել բլոկից՝ թուլացնելով դրա ամրացնող պտուտակները: Հեռացնելով շեմային ֆիլտրը, դուք կարող եք մուտք գործել երկխոս հայելին, որը գտնվում է ֆիլտրի միավորի ներսում: Փոխարինվող զտիչներ տեղադրելիս զգույշ եղեք, որ ֆիլտրերի մակերեսին որևէ սոսինձ չհայտնվի, և ֆիլտրերի հետ աշխատելուց առաջ համոզվեք, որ կրեք ձեռնոցներ և երկխրոնիկ հայելին, որպեսզի մատնահետքերը չհայտնվեն մակերեսին:

Լյումինեսցենտ ուղղահայաց լուսավորիչը կարող է տեղավորել երեք ֆիլտրի ափ և դատարկ դիաֆիլտրի ափ (առանց զտիչների) սովորական լուսավոր դաշտի դիտարկման համար: Զտիչները տեղադրվում են ռելսերի վրա և տեղադրվում են օպտիկական ուղու վրա բռնակով, որն օգտագործվում է ռելսերի դիրքը վերահսկելու համար: Յուրաքանչյուր միավոր գալիս է համապատասխան նույնականացման համարանիշով: Պիտակները տեղադրվում են լուսատուի մարմնի բնիկի մեջ հաջորդական կարգով, որպեսզի օպերատորը հեշտությամբ կարողանա ընտրել ճիշտ ֆիլտրի միավորը լյումինեսցենտային դիտարկման համար:

Բրինձ. 3. Ֆլյուորեսցենտային ֆիլտրերի համակցություններ ստերեոմիկրոսկոպում

Ֆիլտրերի համակցությունների հավաքածուն ներկայացված է Աղյուսակ 1-ում: Այս զտիչները ընդգրկում են լյումինեսցենտային գրգռման և արտանետումների լայն շրջանակ և պետք է օգտակար լինեն շատ կենսաբանական հետազոտություններում՝ օգտագործելով սովորական լյումինեսցենտային ներկեր: Այս ֆիլտրերի համակցությունները հարմար են նաև արդյունաբերական կիրառությունների համար, ինչպիսիք են ֆոտոռեսիստների լյումինեսցենտային պոլիմերային աղտոտման համար IC վաֆլիների վերլուծությունը: Ընտրելով գրգռման/արտանետման ֆիլտրերի համապատասխան համակցություն՝ կարող են օգտագործվել 380-ից 510 նանոմետր գրգռման ալիքի երկարություններ ունեցող լյումինեսցենտային զոնդեր (տես Աղյուսակ 1): Այս ֆիլտրերի համակցությունները նույնպես շատ օգտակար են տարբեր կանաչ լյումինեսցենտ սպիտակուցի մուտանտների հետ ուսումնասիրություններում, ներառյալ դրանց ցիանային և կապույտ սորտերը:

Ֆլյուորեսցենտով պիտակավորված սպիտակուցներով կենդանի բջիջների կուլտուրաներում ազդանշանի ինտենսիվությունը կարող է զգալիորեն աճել, եթե ֆիլտրերի համակցությունները ճշգրիտ համապատասխանեն ֆտորոֆորների գրգռման և արտանետումների պրոֆիլին: Օրինակ, DS-կարմիր ազդանշանների դեպքում ֆոտոդետեկտորների միջոցով կարմիր ֆլուորեսցենցիայի տեսողական դիտարկումը և պատկերումը կարող են զգալիորեն բարելավվել՝ կարմիր ազդանշանը տեղափոխելով ավելի շատ նարնջագույն լույս արտանետելու միջոցով: Բացի այդ, քլորոֆիլային ֆոնային ինտենսիվ ավտոֆլյորեսցենտով բույսերի նմուշներին հարմարեցված ֆիլտրերի համակցությունները հաճախ ավելի արդյունավետ են, երբ պատշաճ կերպով համադրվում են համապատասխան ֆիլտրի և արտանետման ազդանշանի բնութագրերին: Այս չափանիշներից շատերը հաշվի են առնվում մանրադիտակի նախագծման ինժեներների կողմից՝ ստերեոմիկրոսկոպի տարբեր ֆիլտրերի համակցությունների թողունակությունը օպտիմալացնելու համար:

Ներդիր 1. Ստերեոմիկրոսկոպների լյումինեսցենտային ֆիլտրերի համակցություններ

Ֆիլտրի հավաքածու	Գրգռման ալիքի երկարության միջակայք	երկխրոնիկ հայելի	Արտանետման ալիքի երկարության տիրույթ
Կապույտ GFP/DAPI
Կապույտ (EGFP) GFP
GFP թողունակություն
Ընդլայնված GFP թողունակություն
TRITC (Ds-կարմիր)
Դեղին GFP թողունակություն

Ինչպես բոլոր զգայուն միջամտության զտիչները, համակցված տուփի զտիչները ի վերջո ձախողվում են ինտենսիվ լույսի և ուլտրամանուշակագույն ազդեցության պատճառով: Բնութագրերը, ինչպիսիք են թողունակությունը և հաղորդունակությունը, նույնպես փոխվում են, երբ զտիչները օգտագործվում և պահվում են խոնավ միջավայրում: Ավելի երկար կյանքի համար այս ֆիլտրերը պետք է պահվեն ջեռոցում կամ չորացնող նյութով փակ տարայում: Չդիտարկելու դեպքում լուսատուի կափարիչը պետք է փակ պահել՝ զտիչների միջով անցնող լույսի քանակը նվազեցնելու համար: Ֆիլտրը կարելի է մաքրել միայն չոր օդի օգնությամբ, ուղտի մազից փափուկ խոզանակով կամ գազի շշից յուղազերծ գազով: Քերծվածքներից և քերծվածքներից խուսափելու համար երբեք մի սրբեք ֆիլտրերը փափուկ միջամտությամբ պատված ֆիլտրերով ոսպնյակները մաքրող շորով:

Աղեղային լամպերի կենտրոնացում և հավասարեցում

Ստացեք գործնական փորձ՝ աղեղային լամպերը հարթեցնելու և կենտրոնացնելու համար այս Mercury կամ Xenon Burner ինտերակտիվ ձեռնարկով, որը նմանակում է լամպերի հավասարեցման ամբողջ գործընթացը լյումինեսցենտային մանրադիտակով:

Ստերեոմիկրոսկոպների միջոցով կարելի է տարբեր նմուշներ դիտել լյումինեսցենտային լույսի ներքո: 0,5x-ից 1,6x օբյեկտիվ խոշորացումով և մինչև 15x խոշորացման տիրույթով այս ստերեո մանրադիտակները կարող են ապահովել համակարգի ընդհանուր խոշորացում 4x-ից մինչև 540x, ինչը համեմատելի է դասական բարդ մանրադիտակների դիտման տիրույթի հետ: Խոշորացման լայն շրջանակը թույլ է տալիս մանրադիտակներին դիտել ինչպես մեծ կենդանի նմուշներ, այնպես էլ մանր դետալներ բարակ հատվածներում, որոնք ներկված են ֆտորոքրոմներով, որոնք տեղադրված են ապակե սլայդի վրա: Բարձր խոշորացման ֆլյուորեսցենտային դիտարկման օրինակ ներկայացված է Նկար 4-ում: Այն ցույց է տալիս երեք նշանով ներկված հաստ մկան երիկամը: Նմուշը ներկվել է DAPI-ով, Alexa Fluor 488 WGA-ով և Alexa Fluor 568-ով (օգտագործելով Alexa Fluor զոնդերը և մոլեկուլային զոնդերի նմուշը և դիտարկվել՝ օգտագործելով երեք ֆիլտրերի համակցություններ Աղյուսակ 1-ից՝ Կապույտ GFP/DAPI, Endow GFP Bandpass, TRITC DsRed: Այս պատկերը հստակ է: ցույց է տալիս ֆլյուորեսցենտային ստերեոմիկրոսկոպիայի հնարավորությունները բարձր խոշորացումներով բարդ մանրադիտակների համար պատրաստված նմուշները դիտարկելիս:

Բրինձ. 4. Մկնիկի երիկամի հատվածը լյումինեսցենտային լույսի ներքո

Ստերեոմանրադիտակների այլ արտադրողներ առաջարկում են լուսարձակման այլընտրանքային մեթոդներ լյումինեսցենտային գրգռման և դիտարկման համար: Ամենատարածված կոնֆիգուրացիան, որը ցույց է տրված Նկար 5-ում, օգտագործում է արտաքին սխեման լյումինեսցենտային գրգռման համար, որը չի օգտագործում պատկերային մանրադիտակի օպտիկական համակարգը: Լուսավորիչի լույսը սկզբում անցնում է գրգռման ֆիլտրով, այնուհետև մանրադիտակի մարմնի հետևի մասում գտնվող խողովակի միջով: Խողովակի ներքևում տեղադրված է ոսպնյակների համակարգ, որն ուղղում է գրգռման լույսը նմուշի վրա: Այս կոնֆիգուրացիայի դեպքում լույսն ուղղվում է ուղղակիորեն նմուշի վրա ցանկացած խոշորացման դեպքում, դրանով իսկ ապահովելով լյումինեսցենտային լուսավորության նույն ինտենսիվությունը և միատեսակ մուգ ֆոն ցանկացած խոշորացման դեպքում:

Ներկված նմուշի կողմից արձակված երկրորդային լյումինեսցենտային լույսը գրավվում է ընդհանուր առաջնային օբյեկտի միջոցով (Նկար 5) և փոխանցվում է խոշորացման բլոկի ալիքներով մինչև մանրադիտակի վերևի շեմային ֆիլտրերը: Լույսն այնուհետև ուղղվում է դեպի ակնոցները՝ ուղղակի դիտարկման համար, կամ դեպի տեսախցիկի խողովակ՝ թվային պատկերման կամ ֆոտոմանրագրության համար: Այս կոնֆիգուրացիան երկխրոնիկ հայելիների կարիք չունի, և դա նրա հիմնական առավելությունն է, ևս մեկ առավելություն անկախությունն է նախապես հավաքված ֆիլտրի բանկերից, ինչը հետազոտողին ավելի շատ ազատություն է տալիս ֆիլտրերի ընտրության հարցում: Այնուամենայնիվ, այս կոնֆիգուրացիան կարող է հանգեցնել սխալների անփորձ օպերատորների համար՝ զտիչների սխալ համակցության պատճառով:

Բրինձ. 5. Մանրադիտակ՝ գրգռման լույսի ճառագայթների առանձին ուղով

Սնդիկի աղեղային լամպի ինտենսիվ ուլտրամանուշակագույն ճառագայթումը, որն օգտագործվում է որպես ֆլյուորեսցենտային մանրադիտակի գրգռման լույսի աղբյուր, կարող է լուրջ վնաս հասցնել ցանցաթաղանթին: Դա կանխելու համար մանրադիտակների շատ արտադրողներ մարմնի վրա ունեն պաշտպանիչ սարքեր, որոնք զտում են բեմի վրա նմուշը ճառագայթող ուլտրամանուշակագույն լույսը: Այլ նախազգուշական միջոցները ներառում են ուլտրամանուշակագույն անջատման զտիչներ դիտման ուղու և շեղող լույսից պաշտպանություն լուսատուի միավորի շուրջ: Լյումինեսցենտային միջամտության ֆիլտրերի ուղեցույցների և ճոճվող շրջանակների մեջ հաճախ տեղադրվում են ֆիլտրի տեսքով խրոցակներ, երբ դրանք չեն օգտագործվում:

Լյումինեսցենտային ստերեոմիկրոսկոպները հաճախ հագեցված են հատուկ դիֆրագմով, որը գտնվում է սնդիկի լուսավորության միավորի և ուղղահայաց լուսատուի միջև, որպեսզի արգելափակի լամպի վտանգավոր ուլտրամանուշակագույն ճառագայթումը, երբ նմուշը չի դիտարկվում: Երբ դիտարկումներ չեն արվում, այս դիֆրագմը պետք է տեղադրվի լույսի ճանապարհին:

Երբ ֆլյուորեսցենտային ստերեոմիկրոսկոպիայում նմուշները դիտվում են արագ ապոխրոմատիկ օբյեկտներով (1,6x-ից 2,0x), արտացոլումները կամ թեժ կետերը կարող են առաջանալ տեսադաշտի ստորին հատվածներում: Այս արտեֆակտը սովորաբար հայտնվում է միայն խոշորացման ցածր գործակիցների դեպքում և անհետանում է մեծ խոշորացումների դեպքում: Շատ դեպքերում արտացոլումները չեն առաջանում, եթե օբյեկտի խոշորացումը ցածր է (0,5x-ի և 1,0x-ի միջակայքում), անկախ օպտիկական ուղղումից, և այդ էֆեկտը սովորաբար բացակայում է բարձր թվային բացվածքի և ցածր ուղղման օբյեկտների դեպքում (ախրոմատներ կամ պլանային ախրոմատներ):

Ինչպես ցույց է տրված Աղյուսակ 2-ում, ֆլյուորեսցենտային մանրադիտակի մեջ կան բազմաթիվ կիրառություններ, որտեղ օգտագործվում են ստերեոմիկրոսկոպներ: Նմուշների թիվը, որոնք կարելի է հեշտությամբ դիտարկել այս ռեժիմում, շատ մեծ է, և դրանք պատկանում են կենսաբանությունից մինչև արդյունաբերական արտադրություն առարկաների լայն շրջանակի:

Ներդիր 2. Լյումինեսցենտային ստերեոմիկրոսկոպիայի կիրառություններ

Տարածաշրջան	Ծրագրեր - Վերլուծություն
Կենսաբանություն	Գենային արտահայտություն, բջիջների տեսակավորում, դիսեկցիա, զարգացման գործընթացներ, աչքի և մկանների ուսումնասիրություններ
Բուսաբանություն
Դեղագիտություն	Մազանոթային հոսք, դեղեր, շրջակա միջավայրի դիտարկումներ
Հիդրոլոգիա	Ջրի որակը, բջջային կառուցվածքը և ֆիլտրի թաղանթների վերլուծությունը
Ագրոնոմիա	Սերմերի ուսումնասիրություններ, գեների արտահայտություն և տրանսգենետիկա
Էլեկտրոնիկա	Զոդման մածուկ, էպոքսիդային անալիզ, ծածկույթի փորձարկում, պոլիմերների ընտրություն ինտեգրալ սխեմաների համար
Կիսահաղորդիչներ	Ֆոտոռեզիստական ​​աղտոտում, օտար մասնիկներ, արտադրության հսկողություն
Պոլիմերներ	Օտար մասնիկների, դատարկությունների, հատիկների, ոչ պոլիմերացված տարածքների առկայությունը
մետաղագործություն	Ճաքեր, մակերեսային թերություններ, աղտոտվածություն, եռակցում, կոտրվածքների վերլուծություն
նյութեր	Ճաքեր, եռակցում, ածխածնային հոդեր, կողմնորոշման ուսումնասիրություններ
թղթի արտադրություն	Մանրաթելեր, ծածկույթներ և ներդիրներ
Դատաբժշկական փորձաքննություն	Տեքստիլ մանրաթելեր, մարմնի հեղուկներ, մատնահետքեր, թղթադրամներ, կեղծիքներ

Լյումինեսցենտային ստերեոմիկրոսկոպիան դասական բարդ մանրադիտակի համեմատությամբ ունի եռաչափ դիտարկման հատկություն։ Բացի այդ, ստերեո մանրադիտակներն առաջարկում են ավելի մեծ աշխատանքային հեռավորություններ և դաշտի խորություն, ինչը հանգեցնում է ավելի լայն համայնապատկերային տեսադաշտի և ավելի ինտենսիվ ֆլուորեսցենտի: Այս բնութագրերը մեծ նշանակություն ունեն հետազոտողների համար, ովքեր պետք է աշխատեն մեծ կենսաբանական նմուշների և նյութերի հետ, ինչպես նաև այնպիսի մասնագետների համար, որոնք ներգրավված են նախապատրաստական ​​աշխատանքներում, ինչպիսիք են բաղադրիչների հավաքումը, էլեկտրոնիկայի արտադրության վերահսկումը կամ կտրումը: Քանի որ ավելի ու ավելի ճշգրիտ ֆիլտրերի համակցությունները հասանելի են դառնում հատուկ կիրառությունների համար, ստերեոմիկրոսկոպիայում ֆլուորեսցենցիայի օգտագործումը շարունակում է աճել: